实时荧光定量RT-PCR实验流程

1、实时荧光定量反转录PCRReal-Time Reverse Transcription PCR（RT-PCR）1 材料 1. 1 仪器756型紫外分光光度计 国产上海ABI 7300 Real-Time PCR System美国ABI公司RS-28高速低温离心机德国贺利氏公司超低温冰箱 德国贺利氏公司UVP凝胶扫描系统美国UVP 公司微量移液器 德国Gilson公司DYZ-22A型双恒定时电泳仪北京市六一仪器厂DYY-桥式电泳仪北京市六一仪器厂1. 2 试剂RNA提取试剂Trizol Reagent为Invitrogen公司产品；逆转录酶（M-MLV ），核糖核酸酶抑制剂（RNasin），dN

2、TP，Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase），随机引物（Random primers），琼脂糖（agarose）均为美国Promega 公司产品；荧光定量试剂盒：Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I) , BBI公司RNA提取:取约100mg组织于冰浴匀浆器中，加入1ml Trizol (Invitrogen,USA)，迅速研磨成匀浆液，加入200 ml氯仿，震荡30S，冰上放置5 min。4，12000 rpm，离心10 min，取上层水相转移至另一1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混

3、匀，-20静置2h。然后4，12000 rpm，离心20 min，弃上清，加入1ml 75%乙醇，轻轻混匀，4，12000 rpm，离心10min，吸净上清液，于室温下晾干，加入20ml DEPC处理的去离子水溶解沉淀，-80保存备用。反转录（RT）:（试剂盒: Promega，USA）反转录反应液组成如下表：Table 1 Mixed components for synthesis of cDNA first chainComponentVolume（ml）Concentration5×R.T.buffer*51×dNTP2.510mM/ mlRNasin220U/ m

4、lRNA5.38mgRandom Primer10.1ug/ mlM-MLV65 U/ mlNucleasr-Free Water 3.2Total25 42反转录50min，95 5min灭活反转录酶。Syber Green 荧光定量PCR检测：(Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I) , BBI) 仪器型号：ABI 7300 Real-Time PCR System,美国ABI公司PCR反应液组成如下表：Table 2 Mixed components for polymerase chain reactionComponent Volume （ul）R.T.product12×Master Mix10Primer1+1H2O7Total20PCR热循环参数：96 4min，然后三步反应：94 30S，58 30s，72 30s，进行40个循环，于每个循环的第三步即：72 30s收集荧光信号。实时荧光定量PCR结果分析: 扩增完毕后，进入结果分析界面，以GAPDH为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值（RQ值），将RQ值用于统计分析