多参数流式细胞术分析415例成人和儿童B-ALL白血病相关免疫表型(精)

1、多参数流式细胞术分析 415 例成人和儿童 B-ALL 白 血病相关免疫表型作者：刘艳荣，陈珊珊， 常艳， 付家瑜， 张乐萍，王卉， 李玲娣，主鸿鹄， 刘桂兰，陆道培， 黄晓军【摘要】为了探讨FCM在微量残留病(MRD检测中的意义，利用4-6组4色抗体组合，以CD45/SSC设门法对273例成人和142例儿童B系急性淋 巴细胞白血病(B-ALL)患者进行了多参数流式细胞术(FCM免疫分型检测和 白血病相关免疫表型( leukemia associated immunophenotyping, LAIP )分 析。结果表明：根据CD34和CD10的表达特点，可将B-ALL患者分为I型(CD34

2、CD10- ;型( CD34 CD10)；m型(CD34-CD10);W型(CD34- CD10-)。I型和n型患者LAIP的阳性比例分别为100唏口 92%但m型患者 LAIP阳性率只有79.2%,显著低于I型和n型患者。总体 B-ALL患者LAIP的检 出率为90%成人与儿童组无明显差异。而利用CD34/CD10/CD19/CD4一组抗体，LAIP检出率达到77.6%。结论：90%成人和儿童B-ALL白血病患者具有 LAIP,因此对这类患者适宜用多参数流式细胞术进行MRD监测。【关键词】急性B系白血病；白血病相关免疫表型；多参数流式细胞Leukemia-Associated Immunop

3、henotypes in 415Childhood and Adult Patients with B Lineage AcuteLymphoblastic Leukemia by Multiparametric Flow Cytometry Analysis AbstractTo evaluate the significance of FCM in minimal residual disease(MRD)detection,the immunophenotyping and leukemia-associated immunophenotypes (LAIP)of leukemia ce

4、lls from 273 adult and 142 childhood patients with B lineage acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) were detected by four to six antibody combinations of 4-color CD45/SSC gating multiparametric flow cytometry (FCM). The results showed that the B-ALL patients could be classified into 4 subtypes based o

5、n different expression CD34 and CD10 : subtypeI(CD34 /CD10-),subtypen( CD34 /CD10 ) , subtypem( CD34-/CD10 ) , subtypeIV(CD34-/CD10-). The LAIP was observed in 100% and 92% patients of subtype I and subtype n , respectively, whereas only 79.2% in subtype m. The incidence of LAIP in total B-ALL cases

6、 was 90% byusing the antibodies detected in this investigation. There was no significantce different for incidence of LAIP between adult and pediatric patients. LAIP was observed in 77.6% of patients by labeling only CD34/CD10/CD19/CD45 4-color antibody combination. It is concluded that in 90% of ch

7、ildhood and adult B-ALL patients LAIP can be found, which suits MRD detection by multiparameter flow cytometry.Key wordsacute B lineage leukemia； leukemia-associated immunophenotyp es； multi parametric flow cytometryB 细胞型急性淋巴细胞白血病(B-ALL)免疫亚型的MIC诊断标准自1985年起一直沿用至今， 并且被新的WHO分类标准所采用。该标准根据胞浆免疫球蛋白(cIg )和细

8、胞核 内抗原TdT及表面免疫球蛋白(sIg )、HLA-DRffi CD10将B-ALL分为：early-precursors-B-ALL, commom-B-ALL, pre-B-ALL 和 B-ALL4 亚型。用流式 细胞仪检测胞浆抗原的表达，操作较烦琐，有一定难度，且结果不稳定，因此 其在临床的常规检测中应用受到限制。 1997年 Jennings 等 1提出将 BALL 分为：B-precursor-ALL, pre-B-ALL和 B-ALL3亚型，又将 B-precursor-ALL,分为CD10和CD10两类。该系统在 MIC基础上加入CD34 CD20 CD22 CD24 CD9

9、抗原。近几年多参数流式细胞术（FCM的开发和应用促进了对正常 B 细胞分化阶段抗原表达的认识，但是否可通过简便的抗原检测而达到对 B-ALL 进行亚型的分型，本研究对此进行了初步探讨。虽然B-ALL患者的白血病细胞在抗原表达类型和出现的顺序与正常 B祖细胞基本相似，但白血病细胞具有一 些正常细胞不存在或存在比例较低的抗原表达特点，可作为辨认白血病细胞的 标志，文献上对其称为白血病相关免疫表型（ leukemia associated immunophenotypes，LAIP ） 2。利用 FCM通过检测 LAIP 可对 B-ALL 微量残 留病（MRD进行监测，这一方法已成为与聚合酶链反应（

10、PCR并用的检测 MRD勺主要方法。目前国际上对 B-ALL-MRD勺检测结果多来自儿童患者，而且 主要的研究对象为前体 B-ALL （precursor ）。而成人B-ALL患者在免疫表型尤 其是LAIP与儿童患者是否存在区别？ FCM-MR的检测是否同样适合于成人B- ALL患者？及儿童和成人不同亚型 B-ALL患者中LAIP的阳性率是否相同？均不 十分清楚。本室在掌握了正常 B祖细胞免疫表型的基础上3，对415例成人 和儿童B-ALL患者的上述问题进行了研究，以探讨其在 MRD检测中的意义。 材料和方法 研究对象 2000年 8 月至 2005年 6月在我室进行免疫分 型检测的 B-AL

11、L 患者共 415 例，其中初治 409 例，复发 6 例。成人（年龄大于 14 岁）组 273例，中位年龄 32岁（ 15-82 岁），男 160 例，女 113 例。儿童组 142例，中位年龄9岁（2-14岁），男89例，女53例。B-ALL患者的免疫分型检测 取肝素抗凝的骨髓或外周血标本，利用我室设计的 4 色荧光CD7、CD2、CD38-FITC 为 公司）。经流 ） 测定时将正常（4种荧光素分别为：FITC、PE APC PerCF）直接免疫标记法进行 B-ALL的 免疫分型检测，以 CD45/SSC（ side scatter ，侧向散射）设门，故每管均加 CD45-PerCP抗体

12、。主要标记4-6管4色抗体组合，检测的抗原分别为 CD19 CD10 CD34 CD20， CD22， HLA-DR CD13 CD33 CD14 CD5 CD38 CD117 CD11I（ CD13-FITC 为美国 An cell 公司产品， PharMingen 公司产品，其余抗体均购自美国 Becton Drckinson 式细胞仪 （FACSort 型， Becton Dickinson 公司，装备双激光管 淋巴细胞的CD45荧光值调到103左右。每份标本获取10 000个细胞。分析时 以幼稚细胞群中抗原表达细胞 20%作为阳性。由于在仪器设定时将正常淋巴细 胞的CD45荧光值调到1

13、03左右，此时正常B系祖细胞的CD45全部101,因此 CD45抗原以90%田胞101定为CD45阳性（CD45 ），90%田胞101定为CD45 阴性（CD45-），90%细胞101 到102定为 CD45弱阳性（CD4±）。B-ALL免 疫分型的诊断标准参考文献 4。统计学处理 采用成对样本 t 检验和卡方检验。结果B-ALL免疫分型本组B-ALL患者中，CD19全部阳性。由于正常B细胞的不同分化阶段CD34和CD10表达具有明显的阶段性，并且白血病细胞基本保留此 特性，因此我们参考MIC分类标准，并主要根据CD34和CD10的表达，将B- ALL患者共分为4亚型（表1）: I型

14、:CD34 /CD10-，相当于MIC分类Early- Precursor-B-ALL（Pre-pre-B- ALL）; n 型:CD34 /CD10 ,相当于普通 B-ALL（c- B-ALL）;川型:CD34-/CD10，相当于前 B-ALL （Pre-B-ALL） ;型:CD34-/CD10-,相当于B-ALL。总体B-ALL中，以n型患者最多，占 63.1%,m型和I 型分别为18.4%和14.5%;W型最少，占3.8%。成人和儿童组比较，儿童组中 I型患者显著低于成人组（P=0.02）。其它各型比例在儿童与成人和与总体相 比均无显著性差异（表 1 ）。 Table 1. Freque

15、ncy of immunophenotypic subtypes in adult and child patients with B-ALL（略）B-ALL患者LAIP分析 通过与正常B祖细胞进行比较2, 在总体B-ALL中LAIP的主要表现为：抗原表达异常，以 CD45表达异常减弱 （ underexpression ），缺如最为多见，在总体 B-ALL 患者中占 38.6%。而且在4 个亚型中均可见到，这说明完全丧失了分化阶段的特性。其它抗原表达异常 包括 CD19 CD10 CD34异常高表达（overexpressed 或 strong positive）和异常低表达（un dere

16、x pressed 或dim p ositive ）;非同步抗原表达，如n 型、m型和W型B-ALL患者的白血病细胞，在正常 CD19 B系细胞相应发育阶段 除 CD34和 CD10抗原外，CD22、CD38和 CD20表达应为 CD22 CD38 CD20- CD22 CD38 CD20 /-和 CD22 CD38-CD20 ;但白血病细胞可出现 CD34 CD20、 CD34-CD10-CD20- CD34-CD10-CD22- CD34 CD38- CD10 CD38非同步抗原表 达异常；交叉系列抗原表达，如同时表达髓系和T系标志（表2和3）。通过本研究所检测的抗体，415例B-ALL患

17、者中373例（89.9%）患者具有可供 MRDk测的LAIP,其中利用CD10/CD34/CD19/ CD45-组抗体，LAIP的检出率 达到 77.6%。 Table 2. Incidence of LAIP in 415 adult and child patients with B-ALL （略）Note: st -strong positive.B-ALL 各亚型中白血病相关的免疫表型分析本研究所检测的主要抗原的异常表达在各亚型中的比例见表 3和表4。CD45和CD38异常弱表达和CD34 CD19和CD10 的强表达主要见于n型患者，使n型患者总体LAIP阳性率达92.4%。CD33

18、和CD56的异常表达以I型患者多见，且正常 CD19 B祖细胞基本不存在 CD34 CD10-表型，此型患者全部为LAIP，即均可通过免疫表型检测 MRDm型患者 由于CD34阴性，CD10表达也已经减弱，只有 CD20全部阴性占56.4%,高于I型 和儿型（PV0.05）,但其他标志异常率也较低，其总 LAIP率只有79.2%，比I 和n型低，但只与I型相比有统计学差异（P=0.000）。对W型患者，由于其 CD34和 CD10均为阴性，因此失去了 2个非常有意义的标志，LAIP阳性率最 低。与其它3型比均有统计学差异（P=0.001）。但我们发现6/7例患者CD20 为阴性，而此期的正常B

19、细胞，CD20应强阳性，因此通过CD20的检测可能利 于W型患者MRD勺监测。虽然表4显示W型患者LAIP阳性率为56.2%,但LAIP 阴性的7名患者均未检测CD22和CD20因此，如果每位W型患者均检测此两 种抗体，则实际 LAIP 阳性率可能会大大增加。 Table 3. Frequency of LAIP positive patients in subtype of B-ALL （略）成人和儿童组 B-ALL 患者白血病相关的免疫表型分析表4显示成人和儿童组B-ALL患者白血病相关的免疫表型阳性比例，儿童组中 LAIP 阳性率为 90.1%，成人组为 89.7%, 两者 无统计学差异

20、。而儿童和成人 B-ALL各亚型之间及与总体之间均无显著差异。 这一结果说明FCM同样适合于成人B-ALL患者MRD勺监测。Table 4.Percentage of LAIP positive patients in subtype of B-ALL（略） 讨论近几年，由于多参数FCM的建立和应用，我们对正常 B细胞分化阶段抗原表达有了新的认识。文献报道和我们的结果均说明利用CD34/CD10/CD19/CD4可将正常B细胞从最早期到成熟期进行分型。而 1985年 提出的MIC标准所依据的抗原中CD19和 HLA-DR在 B细胞分化全程表达，而对B-ALL来讲，HLA-DR不是一个特异性的标

21、志，因此在诊断 B-ALL进行时可不必 检测此抗原。TdT和CD1（的表达在正常B祖细胞不同分化阶段具有明显的阶段 性，而文献报道5和我们的结果证明，正常 B祖细胞中CD34与 TdT的表达 具有一致性。虽然文献报道Pre-B-ALL TdT为阳性,而相应的同期正常B祖细胞 CD34和TdT应为阴性，但Jennings等1与我们的结果，均显示 pre-B-ALL 中CD34为阴性。这说明TdT在B-ALL中的表达丧失了分化阶段特异性，因此利 用CD34抗原作为亚型的分型标志优于 TdT。cIg和sIg是很好的抗原标志，不 足之处是 cIg 的标记操作较繁琐，同时标记 cIg 和 sIg 也增加

22、检测费用。我们 检测了 B祖细胞中cIg和sIg的表达，结果与文献报道相同7，cIg表达见 于CD34-CD10阶段，属于CD19 B系分化的第n期，sIg表达见于CD34- CD10dim阶段，属于B系分化的第m期,因此我们主要依据CD34和CD10勺表达 将B-ALL患者分为4种亚型。对I型B-ALL，我们的结果说明在正常 CD19 B祖 细胞中无明显的CD34 CD10细胞，而近几年多参数FCM佥测的文章中也未证明 存在此群细胞，但有文献报道存在 TdT CD10 CD19和CD34 CD10 CD19早期幼 稚细胞5,6 。因此CD34 CD10-CD19®胞是否属于B细胞分

23、化的最早期阶 段，尚无定论。但B系ALL患者中，有14沁者CD34阳性而CD10阴性，且与 MIC分型中early Precursors-B-ALL 相似，故将其定为I型。 MIC分型中的c- B-ALL，指CD10阳性但cIg和sIg均阴性的患者，实际上与 CD34 CD10发育阶 段一致。m型与MIC分型中的Pre-B-ALL相同。我们未系统检测B-ALL中CD34 的TdT关系，但文献报道，Pre-B-ALL患者TdT /-。现在看来，CD34 TdT-应属 于LAIP的一种。本组儿童B-ALL的分类结果与1993年前依据MIC标准进行分 型的大宗标本的结果8基本一致。但当时对成人 B-

24、ALL患者的亚型分类中， 由于缺乏 cIg 的资料，因此成人中 Pre-B-ALL 的比例不详。这说明成人 B-ALL 中cIg的检测并不普遍，影响了成人 B-ALL的亚型分型。本研究利用CD34/CD10/CD19/CD4抗体组合，不仅可对 B-ALL进行分型，又弥补了 MIC中 的不足，还可用于LAIP检测和MRD随访。目前对CD22抗原表达的认识已有更 新。 Lucio 9 （1999）、McKenna5 （2001）和我们的结果均证明，在 B 系祖细胞分化发育的早期，即表达 CD22且CD20主要为阴性，因此CD34 CD22 CD20-是 I期B祖细胞的正常表型，并非 LAIP。而2

25、002年发表的 WH白血病和 淋巴瘤的新分类标准中10，还认为早期的B祖细胞为CD22阴性。1999年 前发表的文章中，有将 CD34和CD22同时阳性和CD34 CD22 CD20归于LAIP1。现在分析，这些应为正常表型。造成如此大差异的主要原因是CD22抗体所连接的荧光素不同，如 CD22-FITC,该荧光素的荧光强度较弱。相似的原 因可能造成不同的文献某些抗原表达的差异，如髓系标志的表达。而FITC和PE标记的CD20的表达基本是一致的。FCM主要通过检测LAIP来鉴别白血病细 胞。对B-ALL患者，文献报道LAIP主要有4种表现11-13 :非同步抗原 同时表达，如CD34和胞浆卩链

26、同时阳性；交叉系列抗原表达，如 B-ALL细 胞同时表达髓系和T系标志；抗原表达量异常,如CD10 CD34 CD19过强表达 和CD38 CD45等表达缺失及低表达；光散射信号改变,包括侧向光散射、前向 光散射。本研究结果中，LAIP主要表现为抗原表达量的异常，以 CD45弱表达 或表达缺失最为常见，其它抗原异常依次为CD19 CD38 CD10 CD34交叉系列抗原：髓系或T系表达占24%而CD56表达率达到21%非同步抗原同时表 达主要见于CD20与 CD38。而光散射信号改变在发病时表现较明显，但在 MRD 的检测中，难以利用此标志进行鉴别【参考文献】 1 Jennings CD, F

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