电化学DNA生物传感器设计及在医学检验中的应用进展 - 李博-

1、DNA生物传感器是当前发展最迅速的基因检测方法之一,其应用范围广泛,包括传染病快速检验、疾病基因诊断、环境监测、食品安全、法医鉴定等。用于DNA生物传感器的检测技术包括荧光技术,石英晶体微天平1,电化学发光2,表面等离子共振光谱3和电化学方法4等。在这些方法中,电化学方法因其操作简单、特异性好、灵敏度高、检测费用低、易于微型化、可再生,并且不受样品中脂血、溶血情况干扰等优点而引起了人们的广泛关注。1电化学DNA生物传感器的基本原理电化学DNA生物传感器是以DNA为敏感元件或检测对象,将核酸分子特异性识别过程中产生的信号通过换能器转化为电信号,从而实现对核酸的定性或定量检测。首先将DNA探针固定

2、到电极表面,由于探针与溶液中目的DNA之间的高度序列特异性,使得检测电极具有极强的分子识别能力。在适当的温度、pH和离子强度条件下,已知序列的DNA探针与溶液中的目的DNA序列发生杂交,从而导致电极表面结构的变化,变化的情况可通过电化学杂交指示剂所引起电信号(如电压、电流或电导的变化体现出来,可用循环伏安法5、溶出伏安法6、差分脉冲伏安法7、交流阻抗8等方法对电信号进行检测,进而对目的基因进行定性或定量分析,如图1所示。电化学DNA生物传感器设计及在医学检验中的应用进展李博郑磊王前贾立永摘要电化学DNA生物传感器将电化学方法的高灵敏度和DNA生物传感器的高度序列特异性结合起来,是一种全新的基因

3、检测手段。本文在介绍电化学DNA生物传感器原理的基础上,重点阐述其设计及在医学检验中的应用进展。关键词电化学;DNA生物传感器;医学检验;进展Progress of electrochemical DNA biosensor and application in medical laboratoryLI Bo, ZHENG Lei, WANG Qian, JIA Liyong(Laboratory Medicine Center, Nangfang Hospital, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China

4、ABSTRACTElectrochemical DNA biosensor was a novel technique for detection of DNA which have received wide attention for its high sensitivity and high sequence-specication. Here, we review the progress of electrochemical DNA biosensor and application in medical laboratory.KEY WORDSElectrochemical; DN

5、A biosensor; Medical laboratory; Progress基金项目:广东省科技计划(2008A050200006;2010A030300006作者单位:南方医科大学南方医院,广东,广州 510515通讯作者:郑磊,E-mail:n ab图1电化学DNA生物传感器的原理图Figure 1The principle of electrochemical DNA biosensor2电化学DNA 生物传感器设计进展2.1电极的修饰电化学DNA生物传感器常用的工作电极包括:综述玻碳电极、金电极、铂电极、碳糊电极、石墨电极、氧化铟锡(indium tin oxides,ITO电极

6、等。纳米材料由于其独特的光学、磁学、热学、电学及化学性质成为电极修饰的主要材料。其作用主要有:增加探针在电极表面的固定量;加速电子传递;从而增强传感器的响应信号、提高检测灵敏度。常用的纳米材料主要有碳纳米管9、金属纳米粒子10、金属氧化物纳米粒子11、复合纳米粒子12等。其中复合纳米粒子的修饰性能比一般纳米粒子更好。Zhang等12构建了基于复合钼硫碘纳米线(Mo6S9-xIx纳米线的新型电化学传感器。Mo6S9-xIx纳米线是一种能显示出金属电导率(S300K=2×103 S/m的结构松散的束状平行线。导电性能更强,且因其易于在溶剂中分散成单分子的线状,反应面积更大,从而使得复合钼

7、硫碘纳米线更适于构建纳米级电子器件。2.2DNA探针的固定DNA探针的固定是电化学DNA生物传感器制作中的首要问题,探针的固定量和活性直接影响传感器的灵敏度。近年来常用的固定方法包括:吸附法:该方法较简单,主要是利用DNA片段中带负电的磷酸骨架与带正电的固体基质表面的静电相互作用而将DNA 固定在支持物上的,可直接或利用恒电位13将探针吸附到电极表面。生物素-亲和素法:生物素与亲和素的结合具有专一、迅速和稳定的特点。Chu等14用链霉亲和素-生物素与无垢薄膜组装结合固定DNA探针。通过严格控制薄膜的厚度和化学性质,嵌入其中的链霉亲和素便能够与生物素化的寡核苷酸探针特异结合,并防止其他物质的非特

8、异吸附。共价结合法:这种固定化方法首先要在电极表面或探针上修饰一些活性官能团,如氨基、羧基等,通过这些官能团之间的共价作用固定探针。Li等15将NH2ssDNA序列成功地通过环氧化物/氨基耦合反应共价固定在用溶胶-凝胶技术和自组装技术直接耦合的金电极表面,构建出的电化学DNA生物传感器选择性好,且能再生。自组装法:分子之间在平衡条件下,通过非共价键作用力自发聚集形成热力学稳定、结构确定、性能特殊的聚集体的过程称为自组装。通过分子的自组作用,在固体表面自然形成高度有序的单分子层膜。Hejazi等16在金电极表面自组装修饰包含14碱基肽核酸(peptide nucleic acid,PNA探针和6

9、-巯基-1-己醇的单分子层膜,构建针对HCV病毒3a基因型(pHCV3a核心/E1区目的基因的电化学DNA生物传感器。2.3DNA杂交的指示电化学DNA生物传感器通过电化学杂交指示剂将杂交信号转化为可测定的电信号指示DNA杂交,进而实现特定序列DNA的定性或定量分析。根据来源的不同,电化学杂交指示剂可分为内源型和外源型两类。内源型指示剂主要是指DNA分子中可被氧化还原而产生电化学信号的碱基,主要是指鸟嘌呤和腺嘌呤。外源型杂交指示剂又可根据与固定DNA之间的关系分为标记型和非标记型。其中,标记型指示剂主要是指通过吸附、化学修饰或生物亲和等方法在基因片段上固定一些具有电活性或催化活性的无机或生物粒

10、子,如纳米粒子17、二茂铁18、聚吡咯19、生物酶20等;杂交反应结束后会在电极表面上形成带有电活性官能团或生物酶的杂交分子,利用对其电信号的测定达到测定DNA的目的。Fang等18通过离子锆(Zr将目的DNA的磷酸根基团和二茂铁羧酸氧化还原探针的羧酸基团连接起来,实现对目的DNA的检测。虽然这种方法灵敏性较高,但检测过程涉及合成、标记、分离纯化等,步骤较为繁琐且在操作过程中容易造成样品损失。非标记型电化学指示剂是一类以非共价形式与单链DNA或双链DNA分子选择性结合的电化学活性化合物。基于其与单链或双链DNA分子结合能力的差异,通过电压、电流、电阻等可测指标对DNA 杂交过程发生与否及发生程

11、度进行指示。最常用非标记型电化学杂交指示剂是:亚甲蓝(methylene blue,MB16、二茂铁及其衍生物21,22和各种金属配合物(如钌23、铜24等。除此之外,还有一些药物小分子(如阿霉素25及荧光染料等。3电化学DNA传感器在医学检验中的应用进展3.1感染性疾病的诊断3.1.1细菌感染性疾病:临床上检验细菌感染的常规方法主要包括直接涂片镜检、培养、免疫学检查和针对细菌遗传物质的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR技术。其中,确诊方法是细菌培养。但上述方法均不同程度地存在耗时长、操作繁琐、成本高等问题。而新型电化学DNA生物传感器恰恰可以弥补这些缺陷

12、,简便而快速地对病原体DNA进行检测。Ansari等26用20-碱基的淋病奈瑟菌的特异性硫醇化寡核苷酸探针(th-ssDNA包被在通过溶胶-凝胶方法浸涂在铟锡氧化物玻璃衬底上的氧化锌(ZnO膜上,构建检测淋病的DNA生物传感器。该传感器在60 min内即完成检测,检测的目的DNA线性范围是0.000524 fmol0.524 nmol,检测最低限为0.000704 fmol。Mach等27将针对几种常见尿路感染细菌的16S r RNA的DNA探针包被在电化学传感器微阵列表面,构建了检测尿路细菌感染的多通道电化学生物传感系统,并率先进行了床旁检测(point-of-care testing,PO

13、CT的前瞻性临床试验:对纳入试验的116例患者的109份合格尿标本进行检测,并与金标准尿培养作对比。该方法特异度和阳性预测值为100%,敏感度为89%,阴性预测值为76%。除此之外,结核杆菌28、小肠耶尔森菌9等也可用电化学DNA生物传感器进行检测。3.1.2病毒及其他病原体感染性疾病:病毒感染的实验室检查包括病毒抗原和抗体的检测、病毒核酸的直接检出等。临床上最常见的病毒及其他病原体检测项目包括艾滋病病毒(human immunodeciency virus,HIV、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV、梅毒螺旋体(treponema pallidum,TP、丙型肝炎病毒

14、(hepatitis C virus,HCV、人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV、风疹病毒(rubella virus,RV等,前四种病原学检查的组合即为手术前必做的术前四项。由于急诊手术时间紧迫,常规方法很难满足临床快速诊断及治疗的需求,所以国内外很多研究小组都在努力将电化学DNA传感器应用在HIV29、HBV30、TP31、HCV32的检测中。Zhang 等29构建了一种用数微升样品同时检测HIV两种寡核苷酸序列HIV-1和HIV-2的免标签电化学传感器微阵列模型系统。在最优条件下,HIV-1和HIV-2 的峰电流在20100 nM范围内呈线性,检测下限为0.1

15、 nM(S/N=3。这种生物传感器微阵列特异性很好,没有明显的交叉干扰,而且很容易区分单碱基突变的寡核苷酸、任意寡核苷酸与完全互补的目的DNA。此外,禽流感病毒(avian inuenza virus, AIV17、HPV33等病原体的电化学DNA生物传感器的研究也很受人关注。3.2基因诊断随着医学研究的深入,人们发现许多疾病,如癌症、遗传病甚至一些临床常见疾病的发生都与遗传基因有关。针对特定序列的电化学检测对于疾病的快速诊断、病程监测和预后都有重大意义。Marin等34将膀胱纤维化相关DNA序列夹心于两个DNA探针之间。其中一个探针通过生物素-链霉亲和素连接于磁珠(magnetic, bea

16、d, MB,另一个通过硫醇连接于硫化镉量子点(CdS QD作为标签。用方波电压(square-wave voltammetry,SWV进行电化学检测,得出很好的波形和灵敏的分析信号。Liao 等35构建了一种超敏感的检测甲状腺乳头状癌相关BRAF突变基因的电化学方法。将30个核苷酸的生物素化DNA探针固定在一个链霉亲和素修饰的96孔微量板上,封闭之后,加入生物素化的目的DNA,杂交30 min。然后加入链霉亲和素标记的金纳米颗粒,用方波溶出电压(square wave stripping voltammetry,SWSV技术对杂交过程进行监测。这种方法能很好地识别出现在223个核苷酸DNA上的

17、野生型和突变型BRAF。此外,近年来电化学DNA传感器在点突变36和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNPs37,38检测中的应用也越来越广泛。Luo等37报道一种不需固定探针检测序列特异性DNA和SNP 的多通道电化学方法。利用标记有电活性指示剂的电中性的PNA探针和带负电荷的ITO电极来实现免固定目的DNA的检测。多种不同序列的PNA探针标记上不同的电活性指示剂从而实现对多种DNA或SNP的检测。且对多种目的DNA和SNP同时检测时,相互之间没有干扰。这种简单而有效的免标记技术能够应用于许多领域,特别是POCT。3.3药物应用分析许多药物通过

18、与DNA的相互作用而发挥疗效,因此电化学DNA生物传感器可以作为药物应用分析的重要研究工具。有研究表明39药物与DNA的相互作用能通过鸟嘌呤电化学信号的变化反映出来,进而能够说明药物的作用机制、DNA-药物复合物的性质、结合常数、结合部位及药物作用过程中产生自由基的作用。用电化学DNA生物传感器和差分脉冲电压技术可进行HIV-1反转录酶抑制药依法韦仑(Efavirenz,EFV的药物剂型分析。EFV使固定在石墨电极表面的鱼精双链DNA发生不可逆的氧化作用,通过氧化电信号监测血浆中EFV的浓度。此方法敏感、快速、简单且成本较低。4展望电化学DNA生物传感器因其制作简单、重现性好、灵敏度高、成本低

19、、易于实现微型化等诸多优点得到研究者的广泛青睐。未来电化学DNA生物传感器的研究热点将集中在:传感器设计的的优化:寻求电子性能更好的纳米材料进行电极的修饰,更稳定的探针固定方法及更优良的杂交指示剂;多目标同时检测:可以用一个器件同时测量多种目的基因片段,同时避免相互干扰;微型化:实现可携带式床旁检测(POCT。在此基础上,进一步拓展其临床应用范围,进行规范方法学评价,加强质量控制措施,相信电化学DNA生物传感器能够成为未来临床POCT的重要检测手段之一。参考文献1 Chomean S, Potipitak T, Promptmas C, et al. Quartz crystalmicroba

20、lance-based biosensor for the detection of alpha-thalassemia 1 (SEA deletionJ. Clin Chem Lab Med, 2010, 48(9: 1247-1254.2 Su Q, Xing D, Zhou X. Magnetic beads based rolling circleamplication-electrochemiluminescence assay for highly sensitive detection of point mutationJ. Biosens Bioelectron, 2010,

21、25(7: 1615-1621.3 Wang S, Yang H, Zhang H, et al. A surface plasmon resonance-based system to genotype human papillomavirusJ. Cancer Genet Cytogenet, 2010, 200(2: 100-105.4 Pohlmann C, Sprinzl M. Electrochemical detection ofmicroRNAs via gap hybridization assayJ. Anal Chem, 2010, 82(11: 4434-4440.5

22、Ting B P, Zhang J, Gao Z, et al. A DNA biosensor based onthe detection of doxorubicin-conjugated Ag nanoparticle labels using solid-state voltammetryJ. Biosens Bioelectron, 2009, 25(2: 282-287.6 Du P, Li H, Cao W. Construction of DNA sandwichelectrochemical biosensor with nanoPbS and nanoAu tags on

23、magnetic microbeadsJ. Biosens Bioelectron, 2009, 24(11: 3223-3228.7 Niu S, Wu M, Hu L, et al. Nucleic acid biosensor for DNAhybridization detection using rutin-Cu as an electrochemical indicatorJ. Electrochimica Acta, 2009, 54(5: 1564-1569.8 Ghanbari K, Bathaie S Z, Mousavi M F. Electrochemicallyfab

24、ricated polypyrrole nanober-modied electrode as a new electrochemical DNA biosensorJ. Biosens Bioelectron, 2008, 23(12: 1825-1831.9 Sun W, Qin P, Gao H, et al. Electrochemical DNA biosensorbased on chitosan/nano-V2O5/MWCNTs composite lm modied carbon ionic liquid electrode and its application to the

25、 LAMP product of Yersinia enterocolitica gene sequenceJ. Biosens Bioelectron, 2010, 25(6: 1264-1270.10 Li F, Feng Y, Dong P, et al. Gold nanoparticles modiedelectrode via a mercapto-diazoaminobenzene monolayer and its development in DNA electrochemical biosensorJ.Biosens Bioelectron, 2010, 25(9: 208

26、4-2088.11 Chen C P, Ganguly A, Wang C H, et al. Label-free dualsensing of DNA molecules using GaN nanowiresJ. Anal Chem, 2009, 81(1: 36-42.12 Zhang R, Hummelgard M, Dvorsek D, et al. Mo6S3I6-Aucomposites: synthesis, conductance, and applicationsJ. J Colloid Interface Sci, 2010, 348(2: 299-302.13 Del

27、l'Atti D, Tombelli S, Minunni M, et al. Detection ofclinically relevant point mutations by a novel piezoelectric biosensorJ. Biosens Bioelectron, 2006, 21(10: 1876-1879.14 Chu L Q, Knoll W, Forch R. Plasma polymerized non-foulingthin lms for DNA immobilizationJ. Biosens Bioelectron, 2009, 25(2:

28、519-522.15 Li F, Chen W, Zhang S. Development of DNA electrochemicalbiosensor based on covalent immobilization of probe DNA by direct coupling of sol-gel and self-assembly technologiesJ.Biosens Bioelectron, 2008, 24(4: 781-786.16 Hejazi M S, Pournaghi-Azar M H, Ahour F. Electrochemicaldetection of s

29、hort sequences of hepatitis C 3a virus usinga peptide nucleic acid-assembled gold electrodeJ. AnalBiochem, 2010, 399(1: 118-124.17 Fan H, Ju P, Ai S. Controllable synthesis of CdSenanostructures with tunable morphology and their application in DNA biosensor of Avian Inuenza VirusJ. Sensors and Actua

30、tors B: Chemical, 2010, 149(1: 98-104.18 Fang C, Ji H, Karen W Y, et al. Electrochemical detection ofoligonucleotide by attaching redox probes onto its backboneJ.Biosens Bioelectron, 2010, Epub ahead of print.19 Strand N, Bhushan A, Schivo M, et al. Chemicallypolymerized polypyrrole for on-chip conc

31、entration of volatile breath metabolitesJ. Sensors and Actuators B: Chemical,2010, 143(2: 516-523.20 Zhang Z, Zhou J, Tang A, et al. Scanning electrochemicalmicroscopy assay of DNA based on hairpin probe and enzymatic amplication biosensorJ. Biosens Bioelectron, 2010, 25(8: 1953-1957.21 Fang B, Jiao

32、 S, Li M, et al. Label-free electrochemicaldetection of DNA using ferrocene-containing cationic polythiophene and PNA probes on nanogold modied electrodesJ. Biosens Bioelectron, 2008, 23(7: 1175-1179.22 Fang B, Jiao S, Li M, et al. Label-free electrochemicaldetection of DNA using ferrocene-containin

33、g cationic polythiophene and PNA probes on nanogold modied electrodesJ. Biosens Bioelectron, 2008, 23(7: 1175-1179.23 Das J, Lee J A, Yang H. Ultrasensitive detection of DNA indiluted serum using NaBH4 electrooxidation mediated by Ru(NH363+ at indium-tin oxide electrodesJ. Langmuir, 2010, 26(9: 6804

34、-6808.24 Li X, Ju H, Ding C, et al. Nucleic acid biosensor for detectionof hepatitis B virus using 2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline copper complex as electrochemical indicatorJ. Analytica Chimica Acta, 2007, 582(1: 158-163.25 Ting B P, Zhang J, Gao Z, et al. A DNA biosensor based onthe detection of

35、doxorubicin-conjugated Ag nanoparticle labels using solid-state voltammetryJ. Biosensors and Bioelectronics, 2009, 25(2: 282-287.26 Ansari A A, Singh R, Sumana G, et al. Sol-gel derived nano-structured zinc oxide lm for sexually transmitted disease sensorJ. Analyst, 2009, 134(5: 997-1002.27 Mach K E

36、, Du C B, Phull H, et al. Multiplex pathogenidentication for polymicrobial urinary tract infections using biosensor technology: a prospective clinical studyJ. J Urol, 2009, 182(6: 2735-2741.28 Prabhakar N, Arora K, Arya S K, et al. Nucleic acid sensorfor M. tuberculosis detection based on surface pl

37、asmon resonanceJ. Analyst, 2008, 133(11: 1587-1592.29 Zhang D, Peng Y, Qi H, et al. Label-free electrochemicalDNA biosensor array for simultaneous detection of the HIV-1 and HIV-2 oligonucleotides incorporating different hairpin-DNA probes and redox indicatorJ. Biosens Bioelectron, 2010, 25(5: 1088-

38、1094.30 Wang X, Lou X, Wang Y, et al. QDs-DNA nanosensor forthe detection of hepatitis B virus DNA and the single-basemutantsJ. Biosens Bioelectron, 2010, 25(8: 1934-1940. 31 Sheng Q, Wang J, Zheng J, et al. Ultrasensitive electricalbiosensing of syphilis DNA using target-guided formation of polyani

39、line based on enzyme-catalyzed polymerizationJ.Biosens Bioelectron, 2010, 25(9: 2071-2077.32 Pournaghi-Azar M H, Ahour F, Hejazi M S. Direct detectionand discrimination of double-stranded oligonucleotide corresponding to hepatitis C virus genotype 3a using an electrochemical DNA biosensor based on peptide nucleic acid and double-stranded DNA hybridizationJ. Anal Bioanal Chem, 2010, 397(8: 3581-3587.33 Wang Y, Chen M, Zhang L, et al. Rapid detection of humanpapilloma virus using a novel leaky surface acoustic wave peptide nucleic acid biosensorJ. Biosensors and Bioelectron, 2009,