凝血IX因子复合物的研制

1、    凝血IX因子复合物的研制        摘要目的：提高IX因子复合物的活性收率和IX因子复合物的血栓安全性。方法:采用国产DEAE-sepharose fast flow胶离子交换层析及Ca3(PO4)2吸附法，从新鲜冰冻血浆中直接制备凝血因子复合物。结果:二步的收率分别为(76.42±4.48)%和(74.31±3.17)%，制品的F：C的比活比传统因子复合物提高了约20倍。结论:新的制备工艺可行。关键词凝血因子复合物；国产DEAE-sephar

2、ose fast flow中分类号：R977.6，Q503文献标识码：A文章编号：1006-0103(2000)03-0177-03 PREPARATION OF COAGULATON FACTOR IX COMPLEX CONCENTRATEWU Yang-binYU Rong（Institute of Blood Transfusion, Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing Union College,Chengdu 610081 China）（School of Pharmacy, West China University of Me

3、dical Sciences,Chengdu 610041 China）Abstract OBJECTIVE：To promote the recovery of activity and thrombogenic safety of factor IX complex concentrate, and decrease the cost of the preparation.METHODS: A new factor IX complex concentrate has been prepared from fresh frozen plasma by DEAE-sepharose fast

4、 flow chromatography and Ca3(PO4)2 absorption. RESULTS:The recovery of activity was 67.42%±4.48% and 73.31%±3.17%，respectively.CONCLUSION: The recovery of activity of the preparation is promoted.The cost for the preparation has been sharply decreased. In addition, The protein contaminants

5、in new factor IX complex concentrate has been decreased compared with traditional factor IX concentrate. This demonstrates that the purity and thrombogenic safety of new factor IX complex concentrate have been increased to a centain extent.Key wordsFactor IX complex concentrate；Preparation；DEAE-seph

6、arose fast flow凝血因子复合物是从健康人混合血浆中分离制备的一种主要含Vit K依赖的凝血因子、的血浆蛋白制品，临床上广泛用于治疗乙型血友病和因肝疾患引起的凝血功能异常，以及由于Vit K缺乏而继发的、因子水平低下而致出血，在血液制品市场占有一席之地。传统的因子复合物制备由血浆经DEAE-sephadex A50吸附、洗脱制备而得，不可避免地存在病毒感染和血栓危险性，A50胶机械强度差，胶浆分离困难，回收率低，使用寿命短，制品的成本较高，生产操作困难，质量难以稳定。现选用国产DEAE-sepharose fast flow胶，具机械强度高、流速快、易操作等优点，且价格便宜、使用寿

7、命长、收率高。使制品的成本大大下降，制品质量稳定，血栓安全性有一定提高。1实验部分1.1材料1.2方法4)2SO4分级和Ca3(PO4)2吸附得产品。工艺中还采用了S/D病毒灭活技术(0.3%磷酸三丁酯和1%吐温80，24)，工艺流程如下。8(4×2411.3结果1正交试验直观分析 Fig 1Directive analysis of results分析实验结果可得，影响层析法回收的各因素主次顺序为：A(洗涤液体积)C(洗涤液离子强度)D(洗脱液离子强度)E(洗脱液pH)B(平衡液体积)。最佳条件为A1B1C1D2E2。根据最佳条件重复6次试验，结果见表1。最高效价回收率为84.39

8、%，平均为(76.42±4.48)%(n=6)，优于文献报道的国外采用离子交换层析的回收率68%2。表1最佳工艺条件重复结果Table 1Results of new factor IX complex concentrate's recovery of activity with optimum technologyNO.活性回收率/%FF胶层析Ca3(PO4)2吸附184.3978.08274.4077.33372.1970.55476.2270.88578.2775.21673.0573.79±s76.42±4.4874.31±3.171.

9、3.2Ca3(PO4)2吸附的优化全面考查了(NH4)2SO4沉淀的浓度、Ca3(PO4)2吸附用量、pH、吸附时间及Ca3(PO4)2洗脱液的pH、离子强度等因素对回收率的影响，5次试验，结果见2。2Ca3(PO4)2吸附法优化结果Fig 2Result of the optimization of Ca3（PO4）2 absorption分析5次试验结果认为，试验号2为最佳条件组合，按此条件重复6次，结果见表1，其效价回收率平均为74.31%±3.17%(n=6)。1.3.3因子复合物的蛋白浓度及比活见表2。表2因子复合物的蛋白浓度及比活Table 2Protein concen

10、trate and specific activity of new andtraditional factor IX complex concentrate(n=7)Item新制因子复合物传统因子复合物蛋白浓度/gL16.83±0.7216.88±7.24FCUml134.66±3.624.31±1.12FCUmg15.07±0.530.30±0.151.3.4SDS-PAGE 结果见3，中因子复合物与传统复合物相比，纯度有所提高，蛋白集中在分子量50 00070 000之间，小分子及高分子杂质蛋白均有所减少。 3SDS-PAGE电

11、泳Fig 3SDS-PAGE of protein standard(1,2),traditional factor IX complex concentrate(3,4)and new factor IX complex concentrate(5,6)1，2分子量蛋白标准 3，4传统因子复合物 5，6新因子复合物2讨论以上工艺采用国产DEAE-sepharose fast flow胶离子交换层析和Ca3(PO4)2吸附法制备IX因子复合物。此胶可连续使用2030个循环，且价格仅为进口胶的1/10。经过工艺优化，用国产DEAE-sepharose fast flow胶层析的回收率可达76.4

12、2%±4.48%，优于国外文献报道2采用离子交换层析的回收率水平(68%)；(NH4)2SO4沉淀及Ca3(PO4)2吸附、洗脱的效价回收率可达74.31%±3.17%，也超过了国外一般用Ca3(PO4)2法吸附制备因子复合物的回收率水平(约50%)6。因子复合物制品的主要副作用是病毒传播和血栓危险性，采用S/D法可有效灭活脂膜病毒如HIV、HBV、HCV等，使制品的病毒安全性大大提高，且S/D法对制品的活性损失很少5。此外，从电泳谱分析表明，本工艺制备的因子复合物蛋白集中在分子量50 00070 000区域，这些正是因子复合物制品的有效成份、因子，而其它杂蛋白含量较少，表

13、明制品的纯度有一定提高。从比活(Umg1)看，本工艺制备的因子复合物比传统因子复合物的比活提高了约20倍，也表明纯度有一定提高。另外与致血栓性相关的高分子杂蛋白如高分子量激肽原C4补体等明显减少，有利于制品血栓安全性的提高7,8。因此本工艺制备的因子复合物不仅成本大大降低，而且病毒和血栓安全性有了一定提高。致谢承张兴宇高级工程师， 四川省晨光化工研究所王佳兴教授， 本所杨显福老师、肖小璞副主任技师的鼎力相助。作者简介：邬杨斌，男，现攻读硕士学位。杨斌（中国医学科学院中国协和医科大学输血研究所，四川 成都610081）余蓉（华西医科大学药学院，四川 成都610044）参考文献1，卫生部生物制品标

14、准化委员会.中国生物制品规程(一部)S.北京：人民卫生出版社，1995.2462，Tharakan J, Gee D, Clark D.A semi-continous method for purification of factor IX complex from human plasmaJ. Vox Sang,1989,57:2333，Menache D, Evan D,Orthner CL,et al. Coagulation factor IX concentrate: method of preparation and assessmenf of potential in vivo

15、 thrombogenicity in animal modesJ. Blood, 1984,64:12204，Burnouf T, Michalski C, Goudemand M. Properties of a high purified human plasma factor IX:C Therapeutic concentrate prepared by conventional chromatographyJ. Vox Sang, 1989,7:2255，余蓉.采用S/D法灭活病毒的新型凝血酶原复合物中试研制的初探J.中国生化药物杂志，1997,18(3)：1126，Verfahren zur Herstellung von Blutgerinnungs faktoren und danach hergestellte praparation der fakroren IX and XP. DE 3045152 A1.7，Stein buch M, pejauder L,et al. Steinbuch on prothrombin complex concentrates contact f