人胶质细胞源神经营养因子在大肠埃希菌中高效表达

1、    人胶质细胞源神经营养因子在大肠埃希菌中高效表达        胶质细胞源神经营养因子(GDNF)是近几年来发现并克隆成功的一种新的神经营养因子，它对不同神经元的生长、发育过程都有重要的影响1-3。GDNF对中脑多巴胺能(DA)神经元具有存活、支持作用，对损伤的DA能神经元具有修复作用4，5。GDNF除对DA能神经元有特异性营养作用外，还对胆碱能神经元、去甲肾上腺素能神经元、运动神经元及外周神经系统的各类感觉神经元、交感神经元等均有很强的营养作用。GDNF对6-羟基多巴

2、(OHDA)及神经毒MPTP损伤的黑质纹状体多巴胺能神经元有保护及修复、再生的功能。甚至黑质多巴胺能神经元通向纹状体的神经纤维被切断后加入GDNF能使绝大多数该类神经元免于死亡。GDNF对Parkinsons(PD)和Alzheimers(AD)病的预防和治疗作用在于减慢DA能神经元退变过程，并使残存的DA能神经元轴突增生而增加功能活性以补偿退变的神经元1，4，6。因此，PD大鼠模型动物脑内注射GDNF可明显改善其行为缺陷4，6，应用GDNF可延缓神经元退变过程，减轻各种原因造成的神经系统损伤7-9。由于GDNF在体内表达水平很低，难以从组织中提取，因此，必须采取基因工程手段克隆中国人自己的G

3、DNF基因，构建高效表达载体以获得具有生物学活性的可溶性的非融合蛋白，为研究治疗PD、AD、ALS提供更多的途径。 1材料和方法1.1酶及载体限制性核酸内切酶、Sepharose-6B-heparin等购自华美生物工程公司。高效表达载体PBV220由病毒学研究所基因工程室赠送。1.2GDNF引物设计GDNF mRNA成熟肽端缺乏起始密码子，为获得纯天然非融合蛋白，在上游引物设计时加入起始密码子ATG。5端引物：TAGGATCCATGTCACCAGATGAACAAATGGCA，3端引物：GCAAGCTTCAGATACATCCACACCTT；5和3端引物分别引入酶切位点BamH 和Hind 。1.

4、3RT-PCR扩增GDNF cDNA从人胶质细胞瘤组织中提取总RNA，按Promega试剂盒推荐方法，35个循环获得GDNF cDNA，该片段经BamH 和Hind 双酶切纯化备用。1.4酶切谱分析重组GDNF质粒碱法提取pBV220，用BamH 和Hind 双酶解后纯化出pBV220大片段，加入GDNF cDNA片段，T4 DNA ligase等连接反应过夜，连接反应液转化大肠埃希菌TG1，挑取阳性转化子进行扩增，再纯化出重组GDNF质粒，用BamH 和Hind 消化分析重组质粒相对分子质量大小。1.5重组质粒的表达与纯化重组GDNF质粒在TG1中大量扩增，收获工程菌超声破碎离心，取其上清进

5、行Sepharose-6B-heparin亲和层析，用0.151.5 mol/L NaCl,50 mmol/L PBS(pH8.0)连续梯度洗脱，收获A(280 nm)洗脱峰，置PEG浓缩至所需体积。用Bradford法定氮10。以15% SDS-PAGE考染分析重组GDNF相对分子质量。1.6重组GDNF生物学活性分析解剖镜下挑取9 d龄鸡胚背根神经节对不同浓度GDNF(50，100，200，400 ng/ml)测其生物学活性。96孔“U”板，每孔加入RPMI1640 25 l，神经节一个，不同浓度重组GDNF 25 l，鸡血浆25 l，凝血酶25 l，阴性对照补加RPMI 1640 25

6、l。置5% CO2孵箱37培养3672 h判定结果。2结果2.1RT-PCR扩增结果按Promega试剂盒推荐方法从人胶质瘤组织中提取总RNA，经RT-PCR 35次循环后，1.4%PAGE显示PCR产物约405 bp的特异性扩增条带。2.2重组人GDNF高效表达载体组建与酶切谱鉴定pBV220和PCR产物GDNF基因分别经BamH 、Hind 消化后再纯化出所需片段，加入连接酶连接过夜，转化大肠埃希菌扩增，纯化出rhGDNF DNA,用BamH 、Hind 双酶解鉴定证明插入片段与预计大小一致(1)。    17：重组GDNF DNA约405 bp；8

7、，9：marker1重组GDNF质粒酶切谱鉴定Fig.1Restriction map of recombinant humanGDNF plasmid1-7:Recombinant human GDNF DNA of 405 bp;8:Marker; 9:700 bp2.3重组GDNF的纯化与鉴定收获培养液，超声破碎离心，上清过亲和层析柱连续梯度洗脱，收集洗脱峰，经Bradford法测其蛋白质含量约4 mg/L 15%SDS-PAGE显示GDNF单体的相对分子质量约15 000，见2。    215%SDS-PAGE测定rhGDNF相对分子质量Fig.

8、2Molecular weight of rhGDNFmeasured by 15% SDS-PAGES:rh GDNF. M: Molecular weight marker2.4重组GDNF的生物学活性测定结果以50400 ng/ml重组GDNF用于背根神经节均显示促神经节纤维生长作用，以200 ng最强，50 ng减弱，400 ng则出现对神经节纤维生长的抑制作用，结果见3。3讨论重组GDNF工程菌在超声破碎时加入PMSF经亲和层析显示单一洗脱峰，而不加PMSF约在0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl时出现两个洗脱峰，PAGE显示前者为一条带，后者为两条带，大带相对分子质量同

9、前者约15 000，小带14 000，各带均对DGR显示出生物学活性。因此，认为在无PMSF时出现的14 000带可能系15 000 GDNF被某种蛋白酶降解所致。文献报道重组GDNF在原核表达系统为不溶性包涵体蛋白，需要恢复天然折叠状态才具有生物学活性，而活性要低于可溶性蛋白1050倍。本文报道的重组GDNF为可溶性蛋白组分，不需重新折叠即对DGR有明显的促生长作用。重组GDNF基因全序列测定与文献2比较显示第344位A变为G，即由原来的天门冬氨酸变为甘氨酸；单一碱基改变并未引起GDNF理化性质改变，仍然具有较强的生物学活性；这或许因为改变的碱基靠近羧基末端；本文所示的碱基改变也可能由于GD

10、NF cDNA来源于非正常组织或是PCR技术本身还是种族不同造成，其确切原因有待进一步探索。本文组建的高效表达载体在一升大肠杆菌中可表达约4 mg可溶性蛋白质，使在实验室大量获得纯化GDNF产品成为可能，使应用GDNF成为研究治疗帕金森氏病、早老性痴呆等神经系统退行性疾病的有效途径。    A：阴性对照.B：200 ng rhGDNF3重组GDNF促鸡胚背根神经节生长状况Fig.3Promoting growth of chicken embryo DGR by recombinant human GDNFA:Negative control. B:20

11、0 ng of rh GDNF 该课题为北京市科学技术委员会重点项目作者单位：陈惠（中国康复研究中心北京100077）徐群渊（首都医科大学）杨新科（病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室）参考文献1，Miller G,Martin D,Cullen T. Central administration of rhGDNF cause augmentation of dopaminergic activity in vivo.1994,Soc.Neurosci Abstract,20：1300.2，Lin LFH,Doherty Dr,Lile JD,et al.A glial cell line

12、-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science,1993,260：1130-1132.3，Len FH,Lin,Tie Jin Zhang,et al.Purification and qualification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein age binding. Anal Biochem,1994,72：248-254.4，Don M Gash,Zhi ming Zhang,et al

13、.Function recovery in Parkinsonian monkeys treated with GDNF.Nature,1986,380：21.5，Lin LF,Zhang TJ,Collins F,et al.Purification and initial characterization of rat B49 glial cell line-derived neurotrophic factor.J Neurochem,1994, 63：758-768.6，Jyh Gong, Cabriel Hon,Len Fen H.Lin,Catherlve:Glial cell l

14、ine derived neurotrophic factor extracts neurotrophic effects on dopaminergic neurons in vitro and promotes their survival and regrowth after damage by 1 methyl 4 phenyl pyridinium. J Neurochem,1996,66：74-82.7，E Benda T,Tomac A,Hoffer BJ, et al.Glial cell line-derived neurotrophic factor stimulates

15、fiber formation and survival in cultured neurons form peripheral autonomic ganglia. J Neurosci Res,1995,40：270-284.8，Schubert D,Ling N,Baird A. Multiple influences of a heparin binding growth factor on neuronal development. J Cell Biol,1987,104：635-643.9，Beck KD,Knusel B,Hefta F.The nature of the trophication of brain derived neurotrophic factor and insulin like growth factor-1, and basic fibroblast factor on mesencephalic dopaminergic neuro