人乳头瘤病毒基因分型液态芯片的构建

1、人乳头瘤病毒基因分型液态芯片的构建        【摘要】  目的: 通过构建人乳头瘤病毒基因分型的液态芯片, 建立高通量、 灵敏和特异的HPV型别检测系统。方法: 在LuminexTM平台上, 采用国际公认的标准HPV质粒建立13种基因分型HPV 芯片, 选择引物及探针, 将探针有效的偶联到微球上。结果: 用LuminexTM平台建立了13型HPV芯片, 对单一或两种标准质粒混合的样品均可准确分型。对分型检测的阳性标本进行基因测序, 经美国NCBI数据库BLAST比对符合其检测型别。结论: 利用Lumi

2、nexTM平台构建了13种HPV型别液相芯片的诊断体系, 具有高通量、 快速准确等特点, 适用于大规模临床样本的HPV基因分型的诊断。 【关键词】  人乳头瘤病毒（HPV） 基因分型 芯片人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）基因分型, 对临床HPV感染疾病的诊断与具有重要的意义。目前采用的PCR检测技术假阳性率较高、   Southern blot或反向杂交方法进行操作繁琐, 一次检测样本量有限, 限制了其大规模筛查中的需要。我们拟利用LuminexTM平台系统1-3, 构建人乳头瘤病毒基因分型的液态芯片, 建立特异性强、高通量、高灵

3、敏度的HPV型别检测系统。1  材料和方法1.1  材料 HPV31、 HPV35、 HPV56全基因序列质粒, 由美国 Research and Development Digene Corporation Attila Lrincz教授惠赠; HPV58 全基因序列质粒由日本Toshihiko Matsukura 教授惠赠; HPV45、 HPV51、 HPV53全基因序列质粒, 由德国Heidelberg E.M.de Villiers 教授惠赠; HPV6、 HPV11、 HPV16、 HPV18含HPVL1区质粒的菌悬液, 由第四军医大学皮肤科惠赠。fl

4、uorescencelabeled polystyrene beads （Luminex microsphere荧光聚苯乙烯球, 直径为5 600 nm , 带有功能性羧基, 密度1.25×109/L）购自Luminex公司。TMAC(temtrameihylammdnium chloride)Lot 043k82108、 MES (2NMorpholino ethanesulfonic acid) (C6H13NO4S FW 195.2) lot 042k5467; NLauroylsarcosine Sodium Salt Lot 082k1028均购自Sigma公司, 

5、; EDC: 1ethyl3 (3dimethylamin opropyl)carboclirmide hyddrocloride 购自Pierce (Rockford, IL); streptavidinphycoerythrin(SAPE):  购自Molecular Probes Lot: 83C21。1.2  方法根据LuminexTM平台系统的要求, 选择GP5+/GP6+系统, 采用 de Roda Husman4设计。所有选择的探针M. V. JACOBS5, 通过使用美国NCBI数据库做BLAST比对研究。选择占外生殖器部位HPV感染类型的96%左右的HPV

6、低危类型HPV6、 HPV11和HPV53及高危类型HPV16、 HPV18、 HPV31、 HPV33、 HPV35、 HPV45、 HPV51、 HPV52、 HPV53、 HPV56、 HPV58等为构建液态芯片的首批HPV型别。通过寡核苷酸5氨基与微球表面的羧基在偶联反应液中偶联, 微球表面的羧基点通过MES 和EDC 而激活, 为了减少蛋白在寡核苷酸与微球杂交中的相互干扰现象, 探针设计时通过加上带生物素酶的碳臂, 而有效的结合在微球表面。为了检测探针是否已连接到微球上, 设计偶联探针的互补探针, 在互补探针序列5端加Biotin 修饰。将带有C14臂探针的微球与待测的PCR产物按比

7、例在终浓度为3 mol/L的TMAC反应液中混合, 通过核酸解连、 杂交反应和SAPE染色后, 通过Luminex 100仪器（BIARAD技术平台）检测。阳性质粒抽提后, 以此为模板进行PCR扩增, 将扩增后PCR产物进行浓度梯度稀释, 各稀释产物分别与带有各型HPV探针的微球进行杂交、 染色, 最后进行LuminexTM100仪器BioPlex系统检测, 根据BioPlex管理软件分析采用The Logistic5PL标准曲线。使用SPSS10.0 统计软件包进行统计学分析, 对阳性质粒标准的检测数据, 采用判别分析法, 对结果进行方差分析, 建立判别函数。1   &#

8、160;     2  结果2.1  阳性质粒抽提及PCR检测 各型质粒经过重新抽提后, 检测结果见图1。2.2  阳性质粒PCR产物与微球探针的杂交反应结果用13种带有不同编号的微球分别与HPV6、 HPV11、 HPV16、 HPV18、 HPV31、 HPV33、 HPV35、 HPV45、 HPV51、 HPV52、 HPV53、 HPV56、 和HPV58型探针偶联后, 使13种微球分别带有不同的探针。将这13种微球同时放入一个反应体系中, 在一个反应体系中加入一种HPV的PCR产物, 进行杂交

9、反应, 经LuminexTM100 BioPlex软件分析平台检测（表1）。表1  应用液态悬浮芯片技术检测单纯一型HPV标准质粒结果（略）将2种或3种质粒的PCR产物等量混合后变性, 再分别与13型HPV DNA探针杂交, 经SAPE荧光染色后检测。结果显示2型PCR产物与相应2型探针杂交后, 检测出所对应的荧光值均高于无PCR产物未发生杂交反应探针的荧光值, 平均高出3倍以上。经检测全部13种质粒的检测结果均符合预期值, 没有出现混乱杂交现象, 同时各混杂的阳性PCR产物均可被检出(表2)。表2  应用液态悬浮芯片技术检测两型混合HPV标准质粒结果（略）2.3 

10、; 对照检测 采用HPV液相芯片系统对30例尖锐湿疣标本均检出分型, 检出率为100%, 而采用反向杂交技术建立的人乳头瘤病毒基因分型试剂盒检测, 只有21例可检出基因分型, 检出率为70%。为了验证液相芯片检测的结果, 选择经液相芯片检测阳性的标本进行基因测序。115号为尖锐湿疣标本, 经芯片检测为HPV11型和HPV6型混合感染。选择115#PCR产物送测序, 经上海博亚生物技术有限公司测序GP5+端测序的结果: GAC ACT ATG TGC ATC CGT GAC TAC ATC TGC CAC ATA CAC NAA TTC CGA TTA TAA GGA GAT ACA

11、TGC GCC ATG TGG AGG AAT ATG ATT TAC AGT TTA TTT TTC A。GP6+端开始测序的结果: TCC TTA TAA TCT GAA TTN GTG TAT GTG GCA GAT NTA GAC ACA GAT GCA CAT AGT GTC ATN TTN GTA CTG CGT GTA GTA TCT ACC ACA GTA ACA AAA。经美国NCBI数据库BLAST比对, 结果符合HPV11型和HPV6型。3  讨论    本研究是在LuminexTM100技术平台上开发对人乳头瘤病毒基因分型的检测和

12、定量分析。应用国际上已公认的HPV质粒作为阳性参照标准, 建立了13种HPV型别液相芯片的诊断体系; 对HPV公用引物和13种HPV的探针进行了筛选, 建立了PCR反应体系、 杂交反应体系。研究结果显示, 13种微球探针对相应的产物具有特异的杂交反应, 彼此之间并不相互干扰, 对于产物中有混合型同时存在时也可以有效的检出。通过建立了阳性标准质粒HPV6、 HPV11、 HPV16、 HPV18、 HPV31、 HPV35、 HPV51、 HPV56和HPV58的杂交后反应的浓度标准曲线, 可有效的通过调用标准曲线, 对样品的含量进行定量分析。通过对大量数据进行判别分析, 确立了阳性诊断的标准和

13、特征判别的函数, 检测结果显示每通道通过的微球为80个以上时, 检测的荧光值视为有效值, 同时检测的荧光值去除背景值后, 判别函数大于2时, 视为阳性值。根据特别函数, 对349例标准样本进行回代特别函数判别分析, 判定在特别函数大于2时, 其检测阳性标本的阳性准确率在96.7%以上。    为了验证液相芯片检测的结果, 实验中选择经液相芯片检测阳性的标本进行基因测序, 经美国NCBI数据库BLAST比对, 结果符合检测型别。本研究建立的HPV基因分型的液相诊断芯片与采用反向杂交技术HPV型别诊断试剂盒同时检测临床样品, 结果发现对一些阳性PCR产物的样品, 反向

14、杂交方法未检测出, 而液相诊断芯片可以检出, 说明液相诊断芯片诊断方法的灵敏性优于反向杂交方法；本研究构建的液相诊断芯片操作步骤简单, 诊断方法准确, 一次可进行大量样本的检测, 每一板可上样96份, 因此可完成高通量的检测；同时液相HPV基因分型诊断芯片不仅可精确的检测出HPV的基因型别, 还可对阳性标本进行定量分析, 这对临床HPV感染疾病的诊断和都有着重要的意义。【】  1Ye F, Li MS, Taylor DJ, et al. Fluorescent microspherebased readout technology for multiplexed human sin

15、gle nucleotide polymorphism analysis and bacterial identificationJ. Human Mutation Hum Mutat, 2001, 17(4): 305-316.2Chen J, Iannone MA, Li MS, et al. A Microspherebased assay for single nucleotide polymorphism analysis using single base chain extensionJ. Genome Reash, 2000, 10(4): 549-557.3Kaderali

16、L, Deshpande A, Nolan JP, et al. Primerdesign for multiplexed genotypingJ. Nucleic Acids Research, 2003, 31（61）: 796-802.4Jacobs MV, Husman AM, Van den brule AJC, et al. GroupSpecific Differentiation between high and lowrisk human papillomavirus genotypes by general primermediated PCR and two cocktails of oligonucleotide probesJ. J Clin Microb