丙泊酚对大鼠局脑缺血后线粒体膜电位及ROS生成的影响

1、丙泊酚对大鼠局脑缺血后线粒体膜电位及ROS生成的影响     丙泊酚对大鼠局脑缺血后线粒体膜电位及ROS生成的影响#于巍，李军，李雪婷，戚思华*基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20092307110004） 作者简介：于巍，男，主治医师，脑缺血再灌注损伤机制研究 通信联系人：戚思华，男，教授，脑缺血再灌注损伤及脑保护作用机制研究. E-mail:  extracted mitochondria of group C and group was incubated by propofol for 2 min at 37 and

2、 then incubated by TMRM for 10 min at 37 or incubated by H2DCFDA for 30 min at 37.Flow cytometric detected the signal intensity of TMRM and DCF. TMRM for measuring mitochondrial membrane potential and DCF for measuring mitochondrial reactive oxygen species was evaluated by signal intensity. Results

3、Purity of mitochondria in group was more than 98% 50 ( P<0.05); Mitochondria isolated from the contralateral hemisphere showed high membrane potential and lower production of reactive oxygen species( P<0.05); propofol has been demonstrated to increase membrane potential of mitochondria isolate

4、d from focal cerebral ischemia ,and inhibit reactive oxygen species generation of mitochondria isolated from focal cerebral ischemia( P<0.05); propofol has been demonstrated to increase membrane potential of 55 mitochondria isolated from contralateral hemisphere, while it has no effect on reactiv

5、e oxygen species generation of mitochondria isolated from contralateral hemisphere( P<0.05). Conclusion Propofol shows better preservation of mitochondrial function after focal cerebral ischemia, indicated by inhibition of reactive oxygen species generation and increasing membrane potential of mi

6、tochondria. This may be involved in the mechanism of the brain protection of propofol. 60Key words: Propofol; Focal cerebral ischemia; Mitochondria; Reactive oxygen species; Membrane potential;Flow cytometry.线粒体是细胞内能量转换器三羧酸循环、电子传递和氧化磷酸化均在线粒体内进行。同时，线粒体也是缺血性损害的亚细胞靶目标1。脑缺血再灌注后神经细胞线粒体发生功能障碍，表现为线粒体膜电位的降低

7、和ROS生成的增加，引起线粒体肿胀、破裂，激活65 并释放多种凋亡诱导因子，最终导致神经细胞坏死性和凋亡性死亡2-4。研究发现，丙泊酚能够改善脑缺血后线粒体功能，对脑缺血性损伤具有保护作用，然而其具体机制仍不清除5-7。流式细胞技术是检测颗粒物质特性较为敏感的方法，目前缺少应用流式细胞技术对离体线粒体功能进行分析的研究，本实验应用流式细胞技术观察丙泊酚对大鼠局脑缺血后离体线粒体膜电位和活性氧簇生成的影响，进一步探讨丙泊酚的脑保护作用机制。 701 材料与方法1.1 动物选择及模型建立健康Wistar雄性大鼠，体重250300g，由长春大学动物中心提供，采用线栓法复制大鼠局灶性大脑中动脉栓塞(M

8、CAO)模型8,9。基本操作过程是10%水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉后，通过大鼠颈内动脉颅外段插入一根尼龙线，使其末端抵达同侧大脑中动脉分叉部的75 远端，阻断大脑中动脉及侧支循环的血流。模型成功的标志是大鼠清醒后出现同侧Horner征和对侧前肢为重的偏瘫。1.2 神经学功能评分及模型成功判定标准术后大鼠单笼饲养并观察，清醒后参照Longa等9方法进行神经功能损伤程度的评定，即0分：无神经功能缺损症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对80 侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。评分为23分者被视为成功脑缺血模型。1.3 线粒体提取脑线粒体的分离参照Sims10的

9、方法并加以改进。局脑缺血2 h后迅速断头取脑，冰台上分离前脑缺血核心区皮质及对侧相应部位皮质，立即放入4°C缓冲液（含320mM sucrose、10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH 7.4）中充分剪碎，反复用上述缓冲液冲洗红细胞。然后用手动85 玻璃匀浆器匀浆10次，整个过程均要求在冰浴中进行。匀浆物加入等体积24%的Percoll （Sigma，USA），并置于23和40Percoll密度梯度的离心管中，30700g离心7min，底部两层Percoll中间处的沉淀即为线粒体。线粒体用1:5的分离缓冲液稀释后，再次167000g离心10min，沉淀悬于0.2

10、ml缓冲液中。取适量悬液，采用BCA法测定其蛋白含量。1.4 线粒体纯度的测量 90将提取后的线粒体30ug即刻置于300ul的分析液中(250mmol/L蔗糖，10mmol/L Tris，10mmol/L MOPS，100umol/L Pi,0.5 mmol/L Mg2+, pH 7.0)。加入荧光染料NAO并使其最终浓度为100 nmol/L，于37孵育10分钟后流式细胞仪（FACSCalibar，BD ，USA）分析线粒体的纯度。流式细胞仪用488nm氩激光器，NAO的发射荧光用FL-1通道收集。在R1窗里，每个样本数为10000，实验数据分析用CellQuest软件。 951.5 线粒

11、体选择及分组选择NAO染色率大于95%的缺血区线粒体悬液，随机分成三组：A组、B组、C组；选择NAO染色率大于95%的对侧区线粒体悬液，随机分成三组：组、组、组。1.6 线粒体膜电位的测量将各组30ug线粒体即刻置于300ul的分析液中。加入荧光染料TMRM并使其最终浓度100 为300 nmol/L，于37孵育10分钟后流式细胞仪测量线粒体的膜电位。流式细胞仪用488nm氩激光器，TMRM的发射荧光用FL-2通道收集。在R1窗里，每个样本数为10000，试验数据分析用CellQuest软件。1.7 线粒体活性氧簇的测量将各组30ug线粒体即刻置于300ul的分析液中。加入荧光染料H2DCFD

12、A并使其最终105 浓度为30umol/L，37放置30分钟后流式细胞仪测量线粒体的膜电位。流式细胞仪用488nm氩激光器，DCF的发射荧光用FL-1通道收集。在R1窗里，每个样本数为10000，试验数据分析用CellQuest软件。1.8 统计学处理采用SPSS12.0统计分析软件进行统计学处理，各组计量资料以均数±标准差(x± s)110 表示，组间比较采用单因素方差分析，缺血组和对照组之间比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 线粒体光散射特性各组线粒体样本光散射性质均一，粒子团主要集中于R1窗内。见图1。 115 图1 线

13、粒体光散射特征Fig.1 Light scattering properties of mitochondria2.2 线粒体纯度测量在各组线粒体的样本中，R1窗内粒子的NAO染色阳性率均大于98%（P<0.05)，且粒120 子的荧光强度分布呈单峰状。见图2。图2 线粒体NAO染色Fig.2 Mitochondria stained with NAO 1252.3 线粒体膜电位的测量在缺血区神经细胞线粒体中，经过不同处理后，各组线粒体的TMRM的荧光强度值出现差别，即线粒体膜电位发生变化。与B组相比，C组的线粒体膜电位显著增加（P<0.05)。见图3。 图3 缺血区各组

14、线粒体膜电位比较Fig.3 Compared membrane potential of mitochondria isolated from ischemic cortex tissue在缺血区与对侧区神经细胞线粒体的比较中，组的TMRM荧光强度值显著高于B组，即组线粒体的膜电位显著高于B组（P<0.05)；组的TMRM荧光强度值略高于C组，即组线粒体的膜电位略高于C组（P<0.05)。见图4。 135图4 缺血区与对侧区神经细胞线粒体膜电位的比较Fig.4 Comparison of mitochondrial membrane potential between ischem

15、ic cortex and contralateral hemisphere2.4 线粒体活性氧簇的测量 140在缺血区神经细胞线粒体中，经过不同处理后，各组线粒体的DCF的荧光强度值出现差别，即线粒体ROS的生成量发生了变化。与B组相比，C组的线粒体ROS的生成量显著降低（P<0.05)。见图5。 图5 缺血区各组线粒体ROS生成量的比较 145Fig.5 Compared ROS production of mitochondria isolated from ischemic cortex tissue在缺血区与对侧区神经细胞线粒体的比较中，组的DCF荧光强度值显低于于B

16、组，即组线粒体活性氧簇的生成量显低于于B组（P<0.05)；组的DCF荧光强度值略低于C组，组线粒体活性氧簇的生成量略低于C组（P<0.05)。见图6。 150 图6 缺血区与对侧区神经细胞线粒体ROS生成量的比较Fig.6 Comparison of mitochondrial ROS production between ischemic cortex and contralateral hemisphere3.讨 论脑缺血时，组织内的氧分压迅速下降,造成组织的缺氧，细胞能量代谢发生障碍，同时伴155 有线粒体内各种生化改变。研究表明，大鼠大脑中动脉阻塞缺血2 h，线粒体轻度肿

17、胀 11。Mazzeo等12也对脑缺血及再灌注引起的线粒体超微结构的改变作了大量研究，同样发现脑缺血可引起线粒体肿胀，分解，消失，胞质密度增加。本研究建立大鼠局灶脑缺血模型，在缺血2h后进行大鼠神经功能评分。动物模型制作稳定后，选取神经功能学评分2-3分的大鼠，断头取脑，提取缺血核心区和对侧相同部位脑皮质线粒体。提取后的纯化线粒体进行体160 外丙泊酚干预，用流式细胞仪观察缺血区和对侧线粒体活性氧簇生成的影响及丙泊酚干预后是否对线粒体有保护作用。 在对线粒体研究过程中我们发现：流式细胞仪对于研究细胞器水平的粒子是一个非常有效的工具。与其它试验方法相比，流式细胞仪研究线粒体有以下优点：

18、1、试验分析所须线粒体样本少，尤其适用于分析大脑亚区；2、对线粒体进行特异性荧光染色，可以排除其他细胞165 器的污染，使试验结果更加可靠。所以，本试验应用流式细胞仪进行线粒体的研究。在流式细胞仪分析中，线粒体分析窗R1选定后，我们用线粒体特异性荧光染料NAO进行线粒体染色。在Mattiasson等13的研究中已证实，即使线粒体膜电位发生很强的去极化，NAO对线粒体的染色仍是非常可靠的。在我们的研究中，R1窗内NAO染色阳性率大于98%的线粒体样本用来下一步的试验分析，所以实验样本中其他细胞器来源的污染物是非常少的（见图170 2）。Sims等14发现，在体外3h内4°C条件下，线粒

19、体有较好的生物性功能。在线粒体分离提纯过程中，线粒体的功能急剧恶化，所以，快速的线粒体提纯过程是非常重要的。我们在1h内完成线粒体悬液的制备，随后用来试验分析。如细胞膜电位一样，线粒体膜电位是维护线粒体内外物质平衡，保持线粒体功能正常活动所必需的15。正常情况下，线粒体内膜上生物呼吸链的发生，使内膜两侧质子不均匀分布175 而产生质子梯度，从而形成线粒体膜内负外正的电位差，即为线粒体膜电位。亲脂性阳离子染料TMRM可以通过线粒体膜结构进入线粒体内，并且TMRM进入量与线粒体膜电位呈正比。同时，300nM TMRM不会影响线粒体的代谢，与线粒体膜电位高度的相关性15。在本研究中，局脑缺血组线粒与

20、正常对侧组线粒体相比，膜电位明显降低，进一步证明在局脑缺血过程中线粒体的功能受到严重的损伤（见图4），这一结果与Lee等16的研究结果相似。线粒180 体通透性转换通道(MPTP)是存在于线粒体膜上的一种电压门控性通道,允许各种分子(分子量小于1500)和离子通过线粒体内膜。在脑缺血期，细胞内钙超载直接诱导MPTP的开放。MPTP的不可逆过度开放可导致呼吸链解偶联，ATP合成停止，m崩溃15。我们的前期研究现已证实丙泊酚通过诱导线粒体Cyp-D的表达从而抑制MPTP开放，对线粒体有抗肿胀作用。在本研究中，我们发现：200M 丙泊酚能提高缺血核心区线粒体的膜电位，但对于正常脑组185 织线粒体的

21、影响不明显（见图4）。丙泊酚可能通过抑制缺血区线粒体MPTP的开放，维持线粒体正常的膜电位，从而对线粒体的功能有保护作用。Shao等17的研究显示，丙泊酚具有抑制Call2诱导线粒体肿胀作用，对缺血再灌注过程中线粒体内膜心磷脂有保护作用。在脑线粒体呼吸链中，复合物产生70-80%的ROS，所以我们用丁二酸作为线粒体呼吸的底物18。HE可以检测ROS的生成，激发荧光适合流式细胞仪检测，但是，它检测到190 的ROS信号很弱。H2DCFDA来检测ROS的生成可以得到较强的荧光信号，所以我们用H2DCFDA来检测ROS的生成13。当脑缺血缺氧时，自由基清除酶活性降低、抗氧化物减少，ROS产生急剧增多

22、19。ROS使膜脂质过氧化增强，直接破坏线粒体膜结构，影响线粒体复合物和的活性，进一步增加线粒体内ROS的生成，使线粒体的功能急剧恶化20。在本研究中发现，大脑皮质缺血核心区线粒体与对侧线粒体相比，ROS的生成量高（见图6），195 证明了在局脑缺血期间线粒体的功能发生障碍。200M丙泊酚孵育2min后，缺血区脑皮 质线粒体ROS的生成量明显降低,而对侧区脑皮质线粒体ROS的生成量无明显变化（见图6）。大量生成的ROS通过激活线粒体通透性转运孔道的开放，使线粒体膜电位降低，而丙泊酚具有抗ROS生成的作用，这可能是缺血区线粒体膜电位发生变化的重要原因之一。综上所述，丙泊酚能增加大鼠脑缺

23、血后脑皮质线粒体膜电位，降低ROS生成，这可能200 是丙泊酚脑保护作用的潜在机制之一。参考文献 (References)1 Racay P, Tatarkova Z, Chomova M, et al. Mitochondrial calcium transport and mitochondrial dysfunction after global brain ischemia in rat hippocampus J. Neurochem Res, 2009, 34(8): 1469-1478. 2 Yoshimoto T, Siesjo B K. Posttreatment with

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