SMT对大鼠在体心脏缺血-再灌注损伤超微结构的保护作用

1、    SMT对大鼠在体心脏缺血-再灌注损伤超微结构的保护作用         摘要 目的：研究SMT对心脏缺血-再灌注损伤(IRI)心肌超微结构的影响。方法 ：SD大鼠18只，体重320380 g，随机分为三组：缺血-再灌注组(IR)：夹闭冠状 动脉左前降支60 min，松夹20 min；缺血-再灌注+SMT组(SMT)：再灌注前5 min，股静脉 注射iNOS抑制剂S-methylisothiourea sulfate(SMT 5 mgkg w )，余同IR组；对照组(

2、C)：暴露心脏后，不做任何处理，观察80 min。测量导联心电，测定心肌NO2-+NO 3-、实验前后血清NO2-+NO3-含量，心肌组织透射电镜检查。结果：IR组血清NO2-+NO3-较实验前明显增高(P001)，心肌组织NO2-+NO3 -高于C组(P005)。电镜观察，心肌纤维过度收缩，线粒体肿胀、嵴断裂，排列紊 乱、空泡形成。SMT组实验后血清NO2-+NO3-较实验前降低(P005)，心肌组 织NO2-+NO3-接近C组(P005)、低于IR组(P005)。电镜下，心肌超 微结构损伤明显改善。线粒体群集，电子密度增高，嵴密集、排列整齐，肿胀及空泡明显减 轻。结论：SMT对IRI的心肌

3、超微结构有保护作用。关键词：心脏；缺血-再灌注损伤；一氧化氮合酶;超微结构中分类号：Q463；R3313文献标识码: A文章编号: 1 000-6834(2000)04-0314-04PROTECTIVE EFFECTS OF SMT ON MYOCARDIALULTRASTRUCTURE OF ISCHEMIA REPERFUSION INJURY IN HEART OF RATZHENG Hui-zhen（Department of Physiology）CAI Bo（Department of Physiology）FENG You-hui（Department of Physiolog

4、y）SUN Hong（ Histology and Embryology）CAI Ka ng-rong（Analysis center, Gu angdong Medical College, Zhanjiang 524023）ABSTRACTAim: To Investigate the myocardial ultrastructure effects of SMT on the ischemia reperfusion injury (IRI) in the rat heart. Methods: EighteenSpraqua-Dawley rats were randomly div

5、ided into three groups: ische miareperfusion group (IR), subjected to 60 min of o-cclusion and 20 min o freperfusion of the anterior descending branch of left coronary artery;IR+SM T group (SMT) , given the selective iNOS inhibitor S-methylisothioureasulfate (SMT, 5mg/kg, ) before reperfusion; contr

6、ol group (C), didn'tocclude corona ry artery after exposing heart and observed 80 min.Electrocardiogram (ECG) was r ecorded. Nitrite and nitrate content weremeasured in myocardium and blood seru m. The changes of myocardial ultrastructure were observed with electron microsco pe. Results: Ischemi

7、areperfusion induced ST segment elevation and T waves inversion or tallnessin ECG, damaged myocardial ultrastructure, increa sed nitrite and nitratecontent in myocardium and blood serum after IR compare d with before IR(P<0.01). Administration of SMT improved the changes of ECG and the injuryof m

8、yocardial ultrastructure. Nitrite and nitrate content of myo cardiumwere lower than IR group (P<0.05). The change of nitrite and nitrat e levelof blood serum in SMT group was nearly in C group. Conclusion: SMT canprevent myocardium injury from reperfusion following ischemia.KEY WORDS: myocardium;

9、ischemia reperfusion injury； nitric oxide synthase;ultrastructure.一氧化氮(nitric oxide，NO)在心肌缺血-再灌注损伤(ischemiareperfuslon injur y，IRl)中存在保护和加重损伤双重作用1。有研究报道2,3NO前体L- 精氨酸(L-arginine，L-Arg)或NO供体3-morpholino-sydnonimine-hydrochloride(S IN-1)、硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)、3-(cis-2，6-dimethylpiperidino-sy dn

10、onimine tartrate(CAS-754)等减轻心脏IRI，NOS抑制剂，如L-硝基精氨酸(NG-nit ro-L-arginine，L-NNA)、L-硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl es ter，L-NAME)等加重心脏IRI。也有相反的报道4。我们以往的工作表明5 ，L-Arg或SIN-1、SNP加重心肌细胞缺氧-复氧损伤，而L-NNA与L-Arg联合应用， 减弱L-Arg的细胞损伤作用。目前关于NO在心肌IRI中的作用仍有待进一步阐明。本工作选 用诱导型NO合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抑制剂

11、S-甲基异琉脲硫酸盐(S -methylisothiourea sulfate，SMT)6，观察其对大鼠在体心脏IRI的心肌超微 结构的影响，旨在进一步了解在心肌IRI中，NO加重或保护心肌损伤的实验条件。1材料与方法11动物分组及模型复制健康成年SD大鼠18只(广东医学院实验动物中心提供)，体重320380 g，雌雄各半，随 机均分为3组:(1)单纯缺血-再灌注组(IR组)；(2)缺血-再灌注SMT组(SMT组)；(3)对照 组(C组)。实验前禁食1216 h，饮水不限。用3戊巴比妥钠45 mgkg体重ip麻醉，气管 插管，人工呼吸(DH-140B型，浙江医科大学仪器实验厂)，记录导联心电(

12、ECG-6511 ，上海光电医用电子仪器有限公司)。沿胸骨左缘2 mm处，开胸，剪开心包膜，暴露心脏，I R组用动脉夹夹闭冠状动脉左前降支60 min，松夹，让血液再灌流20 min。SMT组，于再灌注 前5 min，股静脉注射SMT 5 mgkg体重，余同IR组。C组剪开心包膜暴露心脏后，不做任何 处理，观察80min。12心肌组织电镜样本制备实验结束时，取左前壁心尖上方5 mm处的心肌组织，立即投入预冷的25戊二醛固定 ，经PBS漂洗，10四氧化锇固定后，用不同浓度的酒精梯度脱水，再用丙酮脱水，100丙 酮与纯包埋剂1：1混合包埋，加温聚合，定位修块，LKB-V型超薄切片机切片，醋酸铀，柠

13、 檬酸铅电子染色，用透射电镜(H-300)观察超微结构的变化。13NO2-+NO3-含量测定制备10心肌组织匀浆，取05 ml，实验前后血清各01 ml，用硝酸酶还原法测定NO 2-+NO3-含量。测定方法按试剂盒说明书进行，试剂盒购自南京建成生物工程研究 所。14材料S-methylisothiourea sulfate购自Sigma公司，其余试剂均为分析纯。15统计学处理2结果21心电的改变夹闭大鼠左冠状动脉前降支期间，IR组6例动物中有4例，SMT组6例动物中有3例ECG出现 心律失常，所有动物均出现S-T段抬高，T波高耸或倒置，R波低电压，宽而深的Q波。再灌 注期间，心律失常消失，但I

14、R组仍出现明显的S-T段抬高，T波高耸，R波低电压。SMT组S- T段、T波和R波的改变明显改善(略)。22NO2-+NO3-的变化IR组心肌组织NO2-+NO3-较C组高355(P0.05)。SMT组NO2-+NO 3-接近C组，低于IR组(37.6，P005，表1)。血清NO2-+NO3-，C组实验 前后无明显改变。IR组实验后较实验前上升84，P001；SMT组实验后较实验前降 低39，P005。实验前后变化值组间比较，IR组较C组高80(P001)；SMT 组较C组低376(P005)；较IR组低654，(P001，表1)。GroupMyocardiumnmol/mg proBlood

15、 serum(mol/L)BeforeAfterControl652.7±175.534.13±11.2931.4±24.0IR884.3±80.0*31.31±6.8556.6±12.5 SMT642.7±180#33.28±11.3419.6±12.0     *P<0.05， vs control group;#P<0.05, vs IR group； P<0.5,P<0.01,vs before 23心肌超微结构的改变C组心肌纤维排列

16、连续规则，Z线明显，H带可辨，闰盘处肌丝结构完整。线粒体电子密 度中等，结构清晰，嵴排列整齐，嵴间隙明显。毛细血管基膜完整、内皮光滑，壁上可见吞 饮小泡(1)。IR组肌丝结构不完整，部分肌丝过度收缩，肌浆网囊池扩张。线粒体排列紊 乱，部分线粒体肿胀、嵴断裂、局部形成空泡、膜破裂，电子密度降低，或基质内致密物增 多。毛细血管微饮泡增多，并伴间质水肿，向腔面突起明显增多(2)。SMT组肌丝结构完整 连续。线粒体群集，电子密度增高，嵴密集，排列整齐，肿胀及空泡明显减轻(3)。         Fig.1 Myocardi

17、al ultrastructure of control groupShows cardiomyofibril and mitochondria (Mi:mitochondrion,TEM×15 000)         Fig.2 Myocardial ultrastructure of IR groupA: The mitochondria were swelling, creast broken and hollow locally (TE M×15 000)B:Cardiomyofibr

18、il and the endothelium of capillary (TEM×10 000)Mi: mitochondrion, My: cardiomyofibril, Cap: capillary         Fig.3 Myocardial ultrastructure of SM T groupShows the cardiomyofibril and mitochondria of high electron density (A:TEM×15 000;B:TEM×3

19、0000) 3讨论本文结果表明，大鼠冠状动脉左前降支结扎60 min，再灌注20 min，心电仍出现明显 S-T段抬高，T波高耸或倒置，宽而深的Q波，表示心肌仍处在缺血状态，可能存在“低流” 或“无复流”现象。电子显微镜下见心肌肌纤维过度收缩，肌丝断裂，线粒体肿胀，结构破 坏，空泡形成，即已出现超微结构的损害。同时心肌组织及血清NO代谢产物NO2-+NO3-增加，此结果与我们以往报道的7langendorff灌流的大鼠心脏，IRI导致心 肌组织L-Arg转运增加，NOS(包括cNOS，iNOS)活性增高，NO代谢产物NO2-含量增加的结 果一致。心肌IRI的发病学中，中性粒细胞激活和氧自由基生

20、成增多是IRI的主要促进因素 1。由心肌细胞、血管内皮细胞和中性粒细胞产生的超氧阴离子(O2-.)、OH-等， 在再灌注后的最初3 min内释放，这些氧自由基性质活泼，引起脂质过氧化，蛋白质氧化作 用和DNA断裂8。同时再灌注刺激大量NO产生，NO与O2-*反应生成过氧化亚 硝酸离子(ONOO-)，加重心肌损伤。因此，在一些实验模型中应用NO合成抑制剂L-NNA、L -NAME，对心脏IRI或心肌细胞缺氧复氧损伤有保护作用。然而，由于上述NOS抑制剂对NOS 的抑制作用无选择性，既抑制iNOS，也抑制cNOS，这就使得NO的基础释放也受到抑制。因此 ，另一些实验模型观察到，上述NOS抑制剂加重

21、心肌损伤2,3，补充L-Arg或NO供 体则可减轻心肌损伤，说明一定量的NO对于保护心肌免遭缺血后再灌注损伤是十分必要的。 Stephen等9应用SMT，选择性阻断iNOS活性，保留cNOS活性，明显改善新西兰兔 心肌梗塞72 h的心脏功能。本文于再灌注前静脉给予SMT，则心肌超微结构的改变明显减轻 ，心电的改变也明显好转，说明SMT对IRI的心肌起有益作用。由于SMT仅抑制iNOS活性， 阻断了由iNOS激活而诱发的N0生成增加，从而削弱了大量NO与O2-*结合产生ONOO-直接 损害心趴细胞的有害因素；同时由于对cNOS的影响不大，保留了NO的基础释放，从而保留了 NO舒张血管、抑制白细胞

22、侵润、血小板粘附、聚集，减少细胞内钙等作用，维护了冠脉内皮 结构的完整性，减轻甚至消除再灌注期间冠脉的“低流”或“无复流”现象，对心肌缺血后 再灌注是非常有利的。SMT对IRI的心脏保护作用的确切机制，目前尚未阐明，有文献报道 10，LNAME等NOS抑制剂抑制心肌NOS活性，减少NO生成的同时，增加腺苷水平和核 苷酸酶活性，对心脏起保护作用。SMT对IRI的心肌的保护作用是否也通过腺苷途径，有待进 一步研究。以上结果提示：心肌缺血后再灌注期间，调制心肌NO生成，抑制NO过量产生，同时保留 NO的基础释放，是一项有效的防治心肌IRI的措施，值得进一步研究。基金项目：广东省科委攻关资助项目(98

23、02)作者简介：郑惠珍(1952-)，女，广东人，副教授，从事心血管生理及病 理生理学研究。郑惠珍（东医学院生理教研室）蔡波（东医学院生理教研室）冯有辉（东医学院生理教研室）孙宏（组胚教研室，）蔡康荣（粤西高校分析中心，湛江524023）4参考文献1 Yoshiki N. The role of nitric oxide in cardiac ischemia-repe rfusion injuryJ. Jpn Circ J, 1997,61:119-132. 2 Pabla R, Buda A J, Flynn D M, et al. Nitric oxide a-ttenuate s ne

24、utrophi l-mediated myocardial contractile dysfunction after ischemia and reperfusionJ. Circ Res, 1996,78:65-72.3 Beresewicz A, Karwatowska-prokopczuk E, Lewartowski B, et al. Aprotective role of nitric oxide in isolated ischemic/reperfused rat heart J . Cardiovasc Res, 1995,30:1001-1008.4 Naseem S A, Kontos M C, Rao P S,et al. Sustained inhibition of nitric oxide by NG-nitro-L-arginine improves myocardiac function followin gischemia/reperfusion in isolated perfused rat heartJ. J Mol Cell Cardio l, 1995,27:419-425.5 郑惠珍，王述恒，符民桂，等