G-CSF动员对供者T淋巴细胞亚群功能和急性移植物抗宿主病的影响

1、G-CSF动员对供者T淋巴细胞亚群功能和急性移植物抗宿主病的影响 08-03-10 15:41:00 编辑：studa20 作者：刘庆国，杨栋林，黄勇，姜尔烈，周世勇，何依，王志东，王玫【摘要】 为了研究粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员对供者T淋巴细胞亚群功能和急性移植物抗宿主病（aGVHD）的影响，对20例供者G-CSF动员前后的外周血样品，加入佛波醇酯、伊能霉素、莫能霉素体外刺激培养4小时，以3色荧光标记法流式细胞术检测T细胞亚群（分泌INF-、INF-）、型（分泌IL-4、IL-5和IL-10）细胞比例。结果表明： G-CSF动员前外周血CD3+IFN-+ 、CD4+IFN-+ 和C

2、D8+IFN-+T细胞的比例分别为3.2% (0%-45.9%)、 1.3% (0%-23.8%)和1.5% (0%-22.2%)，G-CSF动员后前述细胞比例显著升高，分别为19.2% (0%-53.9%)、9.5% (0%-49.5%)和7.5% (0%-38.1%)。动员前CD3+IL-2+、CD4+IL-2+、CD8+IL-2+T细胞比例分别为1.5%(0%-31%)、0.8%(0%-30.0%)和0% (0%-5.3%)，动员后比例亦明显升高，分别为25.7% (0%-51%)、19.8% (0%-39.7%)、4.6% (0%-20.9%)。T细胞各亚群的IL-4阳性细胞比例在动员

3、后升高不明显。移植早期aGVHD发生组供者的Tc1细胞比例显著高于无aGVHD组。动员后高Tc2比例组，其受者中、重度aGVHD的发生率明显低于低Tc2比例组（分别为20.0%和77.8%）。结论： G-CSF动员使供者外周血的I型T细胞比例增加，动员后高Tc1细胞比例与移植早期aGVHD发生相关，Tc2比例与中重度aGVHD发生率负相关。 【关键词】 G-CSF动员；T淋巴细胞亚群；移植物抗宿主病Influence of G-CSF Mobilization on Functions of Donor T Lymphocyte Subpopulation and Acute Graft-ve

4、rsus-Host DiseaseAbstract To investigate the influence of G-CSF mobilization on functions of donor T lymphocyte subpopulation and acute graft-versus-host disease，peripheral blood samples of 20 healthy donors were collected before and after G-CSF mobilization. The whole blood was diluted with IMDM in

5、 ratio of 11 and then incubated with PMA +ionomycin+monensin at 37，5% CO2 for 4 hours. After being moblized and stained，the IL-4，IFN- and IL-2 positive cells were counted with three-color flow cytometry. The results showed that before G-CSF mobilization，the percentages of donors CD3+IFN-+，CD4+IFN-+，

6、CD8+IFN-+ T cells were 3.2% (0%-45.9%)，1.3% (0%-23.8%) and 1.5% (0%-22.2%) respectively. The percentage of above mentioned cells in donor increased to 19.2% (0%-53.9%)， 9.5% (0%-49.5%)，7.5% (0%-38.1%) respectively after G-CSF mobilization. The IL-2 positive CD3+，CD4+ and CD8+ T cell percentage in pr

7、e-G-CSF mobilized donors was 1.5% (0%-31%)，0.8% (0%-30.0%) and 0% (0%-5.3%) respectively and subsequently increased to 25.7% (0%-51%)，19.8% (0%-39.7%)， 4.6% (0%-20.9%) respectively after G-CSF mobilization. The IL-4 positive T subpopulation did not increased significantly after G-CSF mobilization. I

8、n the early stage after peripheral blood stem cell transplantation，donors Tc1 percentage in aGVHD group was significantly higher than that in non-aGVHD group. The morbidity of severe aGVHD in high Tc2 percentage group was significantly lower than that in low Tc2 percentage group. It is concluded tha

9、t the donors type I T cells increase after G-CSF mobilization，the Tc1 percentage of G-CSF mobilized donor is correlated with the occurrence of aGVHD in the early stage after HSCT，the percentage of Tc2 in donor is negatively correlated with aGVHD morbidity in recipients.Key words G-CSF mobilization；T

10、 lymphocyte subpopulation；acute graft-versus-host-disease 急性移植物抗宿主病（aGVHD）是异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的常见并发症，aGVHD的发生率高达30%-80%，发生aGVHD者因直接和间接原因而死亡的发生率可达50%1。aGVHD主要由T细胞介导，这个病理过程起始于移植物中供者T细胞与受者抗原相遇，随后供者T细胞识别受者抗原发生克隆性扩增，其不仅直接通过细胞毒作用对组织细胞进行攻击，并通过分泌细胞因子间接造成组织损伤。根据细胞因子的产生，T淋巴细胞被分类为型和型T细胞。分泌IFN-、TNF-的CD4+T细胞（T

11、h1）和CD8+T细胞（Tc1）被认为是型T细胞，其在免疫应答过程中诱导细胞介导的免疫和迟发型免疫反应，在抗病毒和清除细胞内抗原方面发挥作用。分泌IL-4、IL-5和IL-10的CD4+T细胞（Th2）和CD8+T细胞（Tc2）被认为是型T细胞，其主要通过促使B淋巴细胞产生IgE和募集嗜酸、嗜碱粒细胞诱导过敏反应，在清除细胞外抗原方面发挥作用2。T细胞群的细胞因子谱可因刺激和所处微环境不同而转换为型或型免疫应答。在人类和小鼠的免疫系统中，型细胞因子能抑制T细胞增殖和Th1细胞因子的产生。由Th2分泌的IL-4具有抑制Tc1合成IL-2的作用，并能下调I型细胞的因子合成、细胞增殖和长期细胞毒性。

12、虽然Tc1和Tc2细胞都具有细胞毒作用，但Tc2的细胞毒作用相对较弱。与Tc1分泌高水平IFN-并促进Th1细胞发育相反，Tc2分泌IL-4不仅对Th2细胞起促进作用并能抑制Th1细胞发育。因此，型和型T细胞相互调节，两者之间的平衡决定着细胞免疫和炎症反应的特征。 在造血干细胞移植中，绝大多数受者的aGVHD发生于T细胞免疫重建后，而由于放、化疗预处理及皮质激素应用导致了胸腺功能异常3，T细胞免疫重建有赖于移植物中成熟T细胞扩增4。因此，供者T细胞的免疫功能特征影响着受者移植后免疫。异基因外周血干细胞移植（allo-PBSCT）的移植物中含有比骨髓移植物高10-20倍的T细胞，但aGVHD的发

13、生率和严重度并无明显增加，而慢性移植物抗宿主病（cGVHD）的发生率显著增高，提示供者T细胞功能在G-CSF动员后具有独特的特征。在本研究中，我们应用佛波醇酯（PMA）+伊能霉素（ionomycin)和莫能霉素(monensin) 刺激培养G-CSF动员前、后供者外周血标本，用流式细胞术检测T细胞亚群的、型细胞比例的变化，探讨供者T细胞亚群、型细胞的比例与aGVHD的相关性，以期有助于了解aGVHD的发生机制。材料和方法病例标本取自2002年11月至2003年7月间在我院进行allo-PBSCT的20例患者。供者中位年龄46岁（21-63岁），其中女13例，男7例；受者中位年龄31岁（14-4

14、6岁），其中女4例，男16例。患者疾病类型包括急性淋巴细胞白血病5例（第1次完全缓解期2例，第2次完全缓解期 2例，部分缓解1例），急性粒细胞白血病第1次完全缓解期4例，慢性粒细胞白血病10例（慢性期7例，加速期2例，急性变1例），重型再生障碍性贫血1例。供者外周血干细胞动员采用惠尔血（日本麒麟公司）5 g/kg皮下注射，1日2次，于第5和第6天采集干细胞。患者预处理采用单次全身照射（TBI）7 Gy环磷酰胺（CY）60 mg/kg2天阿糖胞苷1 g/m2，12小时1次2天方案，或者马利兰（BU）4 mg/(kgd）4天CY 60 mg/kg2天方案。aGVHD预防采用FK506 0.03 m

15、g/kg，或者FK506抗CD25单克隆抗体MTX联用。aGVHD 的诊断标准根据文献5。主要试剂CD8-PerCP（SK2克隆）、PerCP-isotype（X40克隆）、IL-2PE（5344.111克隆）购自Becton Dickinson公司，IL-4-PE（4S.B3克隆）、IFN-PE（4S. B3克隆）、PE-isotype（MouseIgG1）以及CD3-FITC（SK7克隆）购自Becton Dickinson-法默金公司。溶血素（BD FACS Lysing Solution) 、破膜剂（BD FACS Permeabilizing Solution 2） 均购自Becto

16、n Dickinson公司。PMA、伊能霉素(ionomycin)、莫能霉素(monensin)购自Sigma公司。IMDM培养基、胎牛血清等购自Gibco BRL公司。标本采取用肝素抗凝管分别在供者外周血干细胞动员前、动员后收集外周血1 ml。细胞培养肝素抗凝全血1 ml与IMDM 11在培养皿中混匀，并加入佛波醇酯(10 ng/ml)和伊能霉素(500 ng/ml)、莫能霉素(1.7 g/ml)，37、5 CO2孵箱中孵育4小时。细胞表面染色及胞内染色将20 l CD3-FITC和CD8-PerCP分别加入Falcon管中。将培养4小时后的稀释全血200 l分别加入上述各Falcon管，涡

17、旋混匀，室温避光孵育15分钟。15分钟后，各管中加入2-3 ml 1FACS溶血素混匀，室温避光孵育10分钟后500 g 离心5分钟，弃上清。分别加入1破膜剂(BD Permercia 2) 500 l涡旋混匀，室温避光孵育10分钟。完毕后加入2-3 ml洗液（含2热灭活胎牛血清和0.1%叠氮钠的PBS），离心500g 5分钟后弃上清。在对照管中加入PE-isotype，检测管中分别加入IL-4-PE、IFN-PE，室温避光孵育30分钟。用洗液洗1遍，弃上清，以1多聚甲醛悬浮细胞至500 l待测。流式细胞术检测分析样本在FACS Calibur流式细胞仪上进行检测，应用CellQuest软件进行测定和分析。首先在前向散射光（FSC）对侧向散