三株溶藻细菌溶藻活性代谢产物的初步研究

1、林 敏等：三株溶藻细菌溶藻活性代谢产物的初步研究 361三株溶藻细菌溶藻活性代谢产物的初步研究林 敏，潘伟斌*，张太平，李 燕，何鉴尧华南理工大学环境科学与工程学院，广东 广州 510640摘要：已知3株溶藻细菌L7、L8和L18的活性代谢产物具有明显的溶藻效果。为获得较高活性和浓度的目标产物，研究了培养基、碳源、氮源对溶藻效果的影响；为考察溶藻活性代谢产物保存和应用的环境条件，研究了其热、酸稳定性。在牛肉膏蛋白胨、淀粉、查氏和高氏1号4种培养基里，淀粉培养基最适宜用于获得溶藻活性代谢产物。以淀粉培养基为基础，碳、氮源组合依次为淀粉+ (NH4)2SO4、淀粉+(NH4)2SO4，葡萄糖+ K

2、NO3时，3株溶藻细菌的溶藻活性代谢产物溶藻活性最高。这一结果为目标产物的分离奠定了物质背景。3株溶藻细菌溶藻活性代谢产物均具有良好的热稳定性，经热处理后，对叶绿素a的去除率仍高于73%。L7的无菌滤液调至pH值4.0或2.5，2 h后丧失溶藻活性；L8和L18的无菌滤液调至pH值4.0，2 h后未丧失溶藻活性，调至pH值2.5，2 h后丧失溶藻活性。上述结果为溶藻活性代谢产物的分离奠定了基础。关键词：富营养化；溶藻细菌；活性代谢产物中图分类号：X17 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（2007）02-0358-05水体富营养化引起的藻类水华问题，带来各种危害1-3，其防治已成为环

3、境领域的热点和难点。溶藻细菌作为水生生态系统的一部分，其溶藻作用引起众多关注4-5。部分溶藻细菌能够分泌胞外活性物质，对宿主藻类起抑制或杀灭作用6-12。利用溶藻细菌分离筛选高效、专一、绿色的溶藻活性代谢产物，最终开发高效、安全的杀藻剂已成为治理藻类水华问题的新思路7。目前，国内对溶藻细菌的研究处于起步阶段，对于细菌溶藻活性代谢产物的研究尚属空白。本课题组从广州城区某富营养化池塘中分离筛选出3株溶藻细菌，初步研究表明，这些溶藻细菌分泌的活性代谢产物具有明显的溶藻效果，且在碱性条件下溶藻能力较强，利于水华治理。为获得较高活性和浓度的目标产物，也为便于后续的活性物质的分离纯化，研究了培养基、碳源、

4、氮源对溶藻效果的影响；为考察溶藻活性代谢产物的保存和应用的环境条件，研究了其热、酸稳定性，为下一步溶藻活性代谢产物的分离奠定了基础。1 材料与方法1.1 材料 溶藻细菌实验用的3株溶藻细菌是本课题组从广州城区某富营养化池塘筛选获得，编号分别为L7、L8和L18。L7和L8菌株属蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）；L18菌株为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。各菌株在GenBank的登录号分别为DQ459876（strain L7）、DQ486872（strain L8）、DQ459877（strain L18）。 供试藻种选用的藻种为蓝藻中的水华鱼腥藻(Anabae

5、na flos-aquae)，来源于中国科学院水生生物研究所藻种保藏中心。 培养基牛肉膏蛋白胨液体培养基13。牛肉膏蛋白胨固体培养基：每100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基加入琼脂1.52.0 g。淀粉培养基：可溶性淀粉10 g，K2HPO4 1 g，NaCl 1 g，MgSO47H2O 1 g，(NH4)2SO4 2 g，蒸馏水1 L，pH 7.07.2。查氏培养基13。高氏1号培养基13。蓝藻培养基BG1114。1.2 方法 无菌滤液的制备接种细菌于牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基，在生化培养箱30培养24 h后，每个斜面用510 mL灭菌的液体培养基洗脱菌苔，置于30 恒温振荡器中，120 r&

6、#183;min-1，振荡4 d。然后在4 000 r·min-1条件下，离心15 min，收集上清液经0.22 m微孔滤膜抽滤两次，平板涂布进行无菌检验，制成溶藻细菌无菌滤液（以下简称无菌滤液），pH值为66.5。 溶藻试验和溶藻效果的判断（1）藻种培养：藻种经活化后，在(23±0.5) ，光照强度3 000 lx，光暗周期比14 h10 h条件下培养。（2）溶藻试验：取预培养10 d且长势良好的水华鱼腥藻以11的比例加入无菌滤液中，设两个平行，置于人工气候箱中静置培养7 d。（3）溶藻效果的判断：实验藻液中除水华鱼腥藻外，没有其他含叶绿素的植物，因此选用叶绿素a（Chl

7、a）含量的变化考察去除效果15-17。 溶藻细菌培养条件对溶藻效果的影响（1）培养基。以牛肉膏蛋白胨液体培养基、淀粉培养基、查氏培养基和高氏1号培养基等4种培养基分别培养细菌，制备无菌滤液，进行溶藻试验，判断溶藻效果。（2）碳源。以淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖为碳源，培养细菌，进行溶藻试验，判断溶藻效果。（3）氮源。以(NH4)2SO4、KNO3、尿素、NH4NO3为氮源，培养细菌，进行溶藻试验，判断溶藻效果。 溶藻细菌培养条件对溶藻细菌生长的影响以溶藻细菌细胞干物为生物量指标，表征细菌生长情况。取100 mL菌液（菌液的制备见），4 000 r·min-1离心10 min，移去上清液，

8、用5 mL的去离子水将底下的细胞移至事先已恒质量的器皿中，40 烘干48 h除去细胞中水分，称重。 溶藻活性代谢产物的稳定性（1）热稳定性。无菌滤液分别在50 、70 和90 中水浴20 min以及在高压灭菌锅中1.1 kg·cm-3压力下，121 高温处理20 min后，进行溶藻试验，判断溶藻效果。（2）酸稳定性。用氢氧化钠（1 mol·L-1）和盐酸（1+9）溶液分别调节无菌滤液pH值至2.5或4.0，2 h后，调回原pH值，进行溶藻试验，判断溶藻效果。2 结果与讨论2.1 溶藻细菌培养条件对溶藻效果和溶藻细菌生长的影响 培养基图1 培养基对3株溶藻细菌溶藻效果和菌体生

9、长的影响Fig. 1 Effects of culture medium on algae-lying and the growth of three algae-lysing bacteria（0：未处理；1：牛肉膏蛋白胨培养基；2：淀粉培养基；3：查氏培养基；4：高氏1号培养基）(0: unsettled; 1: Beef Extract Peptone medium; 2: Starch medium; 3: Czapek medium;4: Gauses NO.1 medium )溶藻细菌在牛肉膏蛋白胨培养基上生长情况好于其他3种培养基，其无菌滤液的溶藻效果也相对较好（见图1），对叶绿

10、素a的去除率都达86以上。溶藻细菌在淀粉培养基这种培养基中生长情况不如其他培养基，但其无菌滤液对叶绿素a的去除率依次为93，89和90，效果好。L7在查氏培养基中培养，其无菌滤液溶藻效果极差，对叶绿素a的去除率仅有8.3，其他两种菌效果稍好，依次为63和81。3株溶藻细菌在高氏1号培养基中培养后，对叶绿素a去除率依次为45%，49和67。在4种不同培养基中，L7对叶绿素a去除率最大相差48，L8为41，L18为26。牛肉膏蛋白胨培养基和淀粉培养基的溶藻效果较好，但前者是天然培养基，成分复杂，会给后续的溶藻代谢产物的分离纯化工作带来许多困难和不确定性，后者成分简单明确，利于后续工作的进行。 碳源

11、以淀粉培养基为基础，在淀粉、葡萄糖、蔗糖和乳糖4种碳源中，如图2所示，以蔗糖和乳糖为碳源的无菌滤液对叶绿素a的去除率在51%70之间，溶藻效果较差。图2 碳源对3株溶藻细菌溶藻效果和菌体生长的影响Fig. 2 Effects of carbon source on algae-lying and the growth of three algae-lysing bacteria（0：未处理；1：淀粉；2：葡萄糖；3：蔗糖；4：乳糖）(0: unsettled; 1: starch; 2: glucose; 3: sucrose; 4: lactose)以淀粉为碳源时，L7的生物量较小，约只有乳

12、糖的一半，但溶藻效果最好，对叶绿素a的去除率达到83。L8在淀粉的作用下对叶绿素a的去除率达86，而其他3种碳源则小于70。L18以葡萄糖为碳源时，生物量最大，约是其他3种碳源的2倍，溶藻效果最好，对叶绿素a的去除率达88。在4种不同碳源中，L7对叶绿素a去除率最大相差22，L8为20，L18为29。L7和L8归属于蜡状芽孢杆菌，在对碳源的利用方面，相对归属于短小芽孢杆菌的L18而言，更相近。 氮源图3 氮源对3株溶藻细菌溶藻效果和菌体生长的影响Fig. 3 Effects of nitrogen source on algae-lying and the growth of three al

13、gae-lysing bacteria（0：未处理；1：（NH4）2SO4；2：KNO3；3：NH4NO3；4：尿素）(0: unsettled; 1: (NH4)2SO4; 2: KNO3 ;3: NH4NO3; 4:carbamide)以淀粉培养基为基础，L7、L8以淀粉为碳源，L18以葡萄糖为碳源。如图3所示，在硫酸铵、硝酸钾、硝酸铵和尿素等4种氮源中，L7的生物量以在尿素中为最大，约是在硫酸铵和硝酸钾中的2倍，叶绿素a的去除率为81%83，溶藻效果较好且很接近，相差只有2的幅度。氮源对溶藻效果影响很小。图5 3株溶藻细菌经酸处理后无菌滤液溶藻效果的比较Fig. 5 The algae-

14、lying effects of asepsis filtrate after low pH value L8在4种氮源中，叶绿素a的去除率为63%90%。以硫酸铵为氮源时，生物量最小，但溶藻效果好于其他3种氮源，相比以硝酸钾为氮源时，高27%。L18在4种氮源中，以硝酸钾为氮源时，生物量较小，不及以尿素为氮源时的生物量的一半，但其无菌滤液的叶绿素a去除率最高，达92，溶藻效果最好，相比以硝酸铵为氮源时高22。有机化合物尿素为氮源时，菌体生物量高于其他3种无机氮源。最后，L7、L8的氮源为硫酸铵，L18的氮源为硝酸钾。综上所述，溶藻效果和菌体量不成正相关。适合溶藻细菌菌体生长的营养条件不一定适

15、合溶藻活性代谢产物的产生，反之亦然。从对溶藻效果的影响程度看，对L7而言，培养基>碳源>氮源；对L8而言，培养基>碳源或氮源；对L18而言，培养基、碳源和氮源三者相差不大。2.2 溶藻活性代谢产物的稳定性2.2.1 热稳定性 经过热处理后，3株溶藻细菌的无菌滤液对叶绿素a去除率仍高于73%，保持较高的去除率，由此判断，溶藻细菌分泌的代谢产物具有较好的热稳定性。其中，L8和L18的规律性较明显，L8随温度的上升而溶藻活性加强，L18则相反。L7以70 水浴20 min处理的效果为最好（图4），去除率达93%。图4 3株溶藻细菌在不同温度下无菌滤液溶藻效果的比较Fig. 4 Th

16、e algae-lying effects of asepsis filtrate in different temperatures由3株溶藻细菌产生的溶藻活性代谢产物的热稳定性，及其无菌滤液对考马斯亮蓝法进行显色呈阴性18这些现象，推测溶藻活性代谢产物并非蛋白质类物质。2.2.2 酸稳定性 从图5中可见，pH值的改变对3株溶藻细菌的溶藻效果有一定的影响。L7的无菌滤液在pH值调至4.0或2.5，2 h后再调回原pH值，代谢产物的溶藻活性丧失，叶绿素a的含量增加。将L8和L18的无菌滤液的pH值调至4.0，2 h后再调回原值，代谢产物的溶藻活性不受影响，其去除率分别达到88.6%和92.2%

17、。在调至2.52 h后再调回原值时，两株细菌的代谢产物的溶藻活性明显受到影响，L8表现为轻微的抑藻作用，L18的溶藻活性丧失。Nobuyuki19等人的研究也指出，将无菌滤液的pH值调至4.0，进行酸处理后，溶藻活性并未丧失，但他没有研究经更低pH值酸处理后的情况。3 结论 （1）在牛肉膏蛋白胨、淀粉、查氏和高氏1号4种培养基中，淀粉培养基最适宜用于获得溶藻活性代谢产物，其产物溶藻活性高，对叶绿素a的去除率L7可达93%，L8可达89%，L18可达90%。（2）以淀粉培养基为基础，碳、氮源组合依次为淀粉+ (NH4)2SO4、淀粉+(NH4)2SO4，葡萄糖+ KNO3时，3株溶藻细菌L7、L

18、8、L18的溶藻活性代谢产物溶藻活性最高。（3）从对溶藻效果的影响程度看，对L7而言，培养基>碳源>氮源；对L8而言，培养基>碳源或氮源；而对L18，培养基、碳源和氮源三者相差不大。（4）3株溶藻细菌溶藻活性代谢产物均具有良好的热稳定性，经热处理后，对叶绿素a的去除率仍高于73%；2 h后丧失溶藻活性；L8和L18的无菌滤液调至pH值4.0，2 h后未丧失溶藻活性，调至pH值2.5，2 h后丧失溶藻活性。参考文献：1 陈水勇，吴振明，俞伟波, 等. 水体富营养化的形成、危害和防治J. 环境科学与技术，1999，85（3）：5-1.CHEN Shuiyong, WU Zhenm

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32、n, HE JianyaoCollege of Environmental Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, ChinaAbstract: Its known that the active metabolites of three algae-lysing bacteria L7, L8 and L18 have great lytic effect on Anabaena flos-aquae. For getting target products with higher activity and concentration, the effects of culture media, carbon sources and nitrogen sources on algae-lysing were studied. And to find out the condition of conservation and application of the algae-lysing active metabolites, their thermal and acid stabili