SOD的性质、制备以及目前市场分析

1、SOD的性质、制备以及目前市场分析化学化工学院 021131032 蒋鹏摘要： 本文综述了国内外对超氧化物歧化酶的分离纯化方法，并对其性质作了概述，根据其性质讨论了其应用前景，以及目前国内市场现状，为从业提供适当参考。1序言 自1969年McCord和Fridovich首先从牛红细胞中发现了超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase， 简称SOD)以来，已对不同生物来源的SOD进行了广泛的研究。由于它能清除体内的超氧阴离子自由基，对于防御氧的毒性、炎症、衰老及抗辐射损伤等方面起着重要作用，愈来愈受到重视。由此也引起了医药和化妆品行业的注意，并陆续开发成药品和特殊化妆品。本文就目前

2、国内外对SOD的制备方法、性质及在化妆品中的应用前景作一简要综述，并适当引用有关文献，以供对SOD的研究开发和在化妆品上的应用提供依据和参考。2SOD的制备方法21 SOD的类别 超氧化物歧化酶是一类金属酶，因此是具有颜色的色蛋白，含不同的金属则具有不同的颜色。SOD广泛地存在于需氧生物的细胞中。按其所含金属辅基不同可分为三类；第一类含Cu和Zn(简称Cu-Zn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞浆中；第二类台Mn(Mn-SOD)，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中；第三类台Fe(Fe-SOD)，只存在于原核生物中。但也有个别例外，如一些细菌也含有Cu-Zn-SOD。此外还在牛肝中发现一种Co

3、ZnSOD。22 SOD的分离纯化 用不同的方法已从不同种属的生物(包括细菌、真菌、藻类、高等植物、昆虫、鱼、兔、鸡、猪、牛、羊、马、人等)的不同组织(脑、心脏、肝脏、血细胞、精子等)中提取纯化制得SOD。 McCord和Fridovich首先从牛血细胞中分离纯化SOD，继后Puget等从细菌中用DEAESephadex A50、DEAECellulose、CM52层析得到电泳均一的CuZnSOD。Bartkowiak等用硫酸铵分级沉淀，加热或去杂蛋白，Cellulose DE-32层析等步骤从猪肝、猪血细胞制得比活为8，110Umg及11，229Umg的SOD。从牛精子中用高速离心、Seph

4、adex G-100凝胶过滤，再经Cellulose DE32、CM-32层析可得到高、低分子量的SOD。JoLansen采用超过滤浓缩、CM52、Sephadex G50凝胶过滤等由啤酒酵母纯化得到高比活(9300Umg)的SOD，纯化169倍，但步骤较繁。Gartnek等从牛血中利用热变性、经DEAE-Sephadex、Sephadex G75制得SOD，虽方法较简单，但比活较低(1700Umg)。Asayama等采用热变性、DE52、CM52层析由人肝同时纯化出MnSOD及CuZn-SOD，收率分别为18及20%。 从上述各种分离方法可以看出，大多采用热变性去杂蛋白，硫酸铵分级盐析沉淀，

5、凝胶过滤、各种离子交换层析的重复或不同层析技术的组合。国内制备SOD一般用猪、牛血作原料，采用上述大体相同的步骤，生产出合符药用及化妆品用的SOD，具有原料来源容易、成本低、使用方便等优点。以下介绍国内分离方案。3. 国内分离方法技术指标： 以动物血为例，其主要制备工艺为：新鲜血液离心得红血球溶血去血红蛋白超滤柱层析冷冻干躁成品。 产品为冻干粉剂，酶纯度3000u/mg蛋白以上。 投资规模与预计效益： 每日投料100kg血或500kg血或根据客户要求。产量为2kg或10kg的SOD冻干粉，产值分别为60万和300万，如果出口效益更好。本工艺利润通常在30%左右。设备投资为30万左右，后为50万

6、左右。 推广应用领域及情况： 已产业化，产品已广泛应用于化妆品、牙膏、啤酒、饮料和保健品胶囊等，获得良好的经济效益。4. 国内研究成果4.1 益微SOD的研究与应用利用植物内生的芽孢杆菌变异株提取SOD精酶，可用于医药生产；利用高含SOD菌株生产微生物制剂“益微”，是植物防病、增产和绿色食品生产的微生物“药肥”；多种果树和蔬菜在喷施益微SOD药肥后，水果和蔬菜中的SOD含量显著提高，即所生产的水果为SOD功能水果。分离出锰及铜锌SOD基因3条。具体技术要点如下：1. 由25000余株菌株中筛选获得了1株高产SOD的蜡样芽孢杆菌菌株（菌株保藏号CGMCC 0175），该菌株产生Cu/Zn、Mn、

7、FeSOD等3种SOD酶，每克活菌能提取0.42mg；具有优良的产业化性状。用该菌株所产的SOD酶具有极强的热稳性，在70条件下处理20分钟，酶活为的50%，10010分钟还保持37%； 2. 建立了稳定高效的液体发酵和固液结合生产发酵工艺，含菌量>3.0×1010cfu/g，最高可达到7.0×1010cfu/g。3.建立了高效的后处理工艺，获得了3种精酶制剂和1 种菌制剂。4. 研制了“益微SOD”微生态制剂。该制剂在植物上应用具有多重功效：促进植物生长、增加作物产量10-15%；增加菜籽油中棕榈酸4.7%，硫甙含量下降8.9%；使果品表面着色好，甜味增加，耐贮存；

8、还可使棉花萎蔫病减少43-63%。5. 首创SOD天然功能绿色果蔬产品。利用本项技术发明制备SOD制剂，将SOD制剂应用到作物上，提高作物体内SOD，获得高含SOD的天然功能食品。目前已开发出SOD功能果品包括苹果、草莓、茶叶等21种。上述这些果品在深加工过程中仍可保持较高的SOD酶活。截止2003年底累计新增产值5837.3万元，新增销售额13605.0万元，新增利税12402.0万元。预计2004年年底通过应用益微SOD专利技术，可以实现新增利税（纯收入）12722.48万元，经济效益明显。6获得发明专利1项：“一种产生超氧化物歧化酶的芽孢杆菌及其生产方法”，ZL93103774.3。发表

9、论文12篇，获得国家级新产品证书。7. 分离获得了锰和铜锌3个SOD酶基因，构建了载体，进行了原核和真核表达，初步探索了发酵工艺真核表达菌株的发酵生产工艺。构建了M22基因组文库，为后续基因分离奠定了基础。4.2 注射用SOD目前注射用SOD可能被批准生产。影响SOD临床应用的主要因素有体内半衰期短和有时对个别病人产生一定的致敏性。为解决这些影响因素，国内外用化学修饰的方法对其进行改造，美国用聚乙二醇（PEG）修饰的SOD已进入III期临床试验。本成果研制了低抗凝活性肝素（LAAH）修饰的SOD（LAAH-SOD）。 技术特点：LAAH-SOD的活性可保持原酶的80%以上；体内半衰期由修饰前的

10、0.675小时延长到6小时以上；LAAH-SOD的抗炎活性较天然酶大为增强；LAAH-SOD本身没有抗原性，与SOD抗体产生交叉抗原-抗体反应的能力也降为天然酶的1/8；LAAH-SOD对热、酸、碱及蛋白酶的稳定性较天然酶大大提高。 应用范围：作为药物开发，LAAH-SOD可用于因过量超氧自由基产生引起的各种疾病（如上述），并由于LAAH-SOD兼有肝素的抗凝、抗炎和SOD清除超氧自由基的双重活性，对缺血性脑卒中的防治可能具有独特的效果。LAAH-SOD亦可用作具有美肤作用的化妆品添加剂。 转化条件：具有药品生产许可或精细化工生产条件的厂家。 市场预测：由于LAAH-SOD应用广泛，具有大的市

11、场需求。 经济效益分析：LAAH-SOD生产原料丰富，其广泛使用必将产生大的经济效益。5. 国内水果种植情况及市场分析SOD苹果就是利用一定的生产技术，使正常生长的苹果富含SOD，成为科技含量较高的功能食品(具有营养功能、感觉功能和调节功能)。下面简单介绍其发展前景和生产技术。1 前景看好 2002年，三门峡市从中国农业大学引进专利的SOD苹果生产技术，在陕县山富果业、灵宝市园艺场、寺河乡上捻园艺场等种植基地开发成功，并在全市迅速推广，成为全国乃至国际上惟一的SOD苹果生产基地，在中国苹果生产史上具有里程碑的意义。经中国农业大学植物生态研究所、中国科学院沈阳理化测试中心两家国家级检测认证机构认

12、证，所产果品各项指标符合国家和联合国卫生组织规定的标准，其中SOD含量为263个酶活单位/100g，达到了目标要求。在市场经济的调节下，2003年该市通过自愿报名、基地验收、技术培训等手段，又选定了80h优质基地，生产出了1200t高档次的符合质量要求的SOD苹果。截至目前，全市共建成995hSOD苹果试验基地，生产SOD果品1500t，实现产值930万元。 经市场调查，SOD苹果每个卖到4.0011.00元，每公斤售价8.0020.00元，且供不应求。订单销售量达到90，远销到北京、上海、广州等城市，部分出口到法国、挪威等欧洲国家。凡是应用SOD苹果生产技术的果农，也都取得了很好的收入。如陕

13、县菜园乡过村郝健康和郝占牢分别有26668和1000红富士果园，2002年收入2万元和600元，2003年应用SOD技术后收入7万元和7000元。2 生产技术 SOD菌株来源于内生共芽抱杆菌，应用到植物体内可以繁殖和转移。 目前SOD苹果生产技术有树上喷施和树干注射两种，但以喷施为主(树干注射正在试验之中)。采用中国农业大学研制的SOD系列微生物制剂，配制成一定的浓度，分次喷洒在生长期的苹果树上。由于它的大量繁殖，并通过树枝、树叶和幼果等树体各部分的代谢和吸收，使苹果果实含SOD 29049090酶活单位/100g，高于标准20酶活单位100g的要求。SOD最大特点是其耐温抗热性达100

14、76;C，30min内能保持一定量的酶活。21 果园选择 适于生产SOD苹果的园地，首先，必须生态条件良好(海拔700m以上)，远离污染源，土壤肥沃，树体通风透光，实行无公害病虫防治等。即SOD苹果生产就是在无公害苹果生产的基础上，通过应用SOD制剂，使其所产苹果为富含SOD的果品。其次，园主要有较强的科技意识和市场意识，能严格按照SOD苹果生产规程进行管理。主要是，所有果实都要套袋并以纸袋为主，选用高效低毒农药防治病虫，适时适量喷施SOD制剂，果面贴印SOD苹果商标等。22 适时喷施 每6667果园需SOD 300g，分6次喷施，每次50g，兑水200kg。喷施时期分别是现蕾期1次，幼果期1次(套袋前)，套袋后3次(间隔2530d)，除袋后喷最后1次。 注意事项：SOD制剂可以与肥料混用，化学药剂中不要与杀菌药剂混用；应用时要混合均匀，并仔细喷洒叶片、树干及果实等部位；喷施时间最好在上午10时前和下午3时后，有益于芽孢杆菌的萌发和生长(中午阳光强会影