年产1000吨酸性蛋白酶的生产工艺设计

1、1. 刖言酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.5? 5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为 30000 ? 40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物 ，包括胃蛋白 酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物酸性蛋白酶可分 为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶.根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一 类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉和栗疫霉等。 细菌未发现产酸性蛋白 酶的菌株.由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、 轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。国外关于酸性蛋白酶的生产研究

2、从 20世纪初就开场了。1908年，德国科学 家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的鞣质。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶在酸性，碱性和中性的条件下都能分解蛋白质的酶 并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进展了广泛的研 究。1964年外国科学家首次发现大抱子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋 白酶，即酸性蛋白酶和酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌，中别离出了 一种酸性蛋白酶，并对该酶进展了纯化和结晶。1968年从微小毛霉中筛选出了一种酸性蛋白酶，并对其进展了纯化和酶学性质分析。1

3、995年外国科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进展了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出了一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进展了核苷酸序列分析和功能分析。国外学者对曲 霉酸性蛋白酶的构造和功能等己经研究的较为透彻。与国外相比，我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年工业微生物研究所首先从黑曲霉中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，并和酒精厂协作进展中试生产，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白.近年来国在酸性蛋白酶上的研究大都致 力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，并获得了一些很有应用前途的产酶菌株。 目前用于酸性蛋白酶生产的高产菌株主要有黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉及它们的突变株。永泉等，对宇佐美曲霉所产的

4、酸性蛋白酶进展了发酵过程动力学研究 戚淑威等对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进展了分析。必峰等，采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法别离纯化了黑曲霉产酸性蛋白酶，并对其氨基酸组分进展了分析。2008年王云等，通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋白进展了分析比对和鉴定酸性蛋白酶分子生物学方面的研究，国仅仅集中于凝乳酶和胃蛋白酶方面，有关真菌酸性蛋白酶的分子生物学研究报道很少摘要：本课题设计是利用黑曲霉Aspergillus niger3.350制备酸性蛋白酶，主要从菌种的选育，培养基的配置，灭菌，种子扩大培养，和发酵罐的设计，发酵车间的物料衡算，发酵过程的工艺控制，下游加工十点进展。阐述了10

5、00吨饲用酸性蛋白酶的制取工艺。其中对发酵罐做了创新性设计。2. 菌种的选育2.1菌种的制备不管在过去、现在和将来，微生物是各种生物活性产物的丰富资源。在发酵 前期，微生物的选择至关重要，此课题设计的是利用黑曲霉发酵生产酸性蛋白酶 的整体过程。选择性别离的一般步骤如下：含微生物材料的选择 材料的预处理 所需菌种的别离 菌种的培 养一一菌种初筛一一菌种复筛一一性能鉴定一一菌种保藏。本实验选用黑曲霉作为菌种，发酵生产酸性蛋白酶，该霉菌株在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为 3. 350。而黑曲霉Aspergillus niger丨生产酸性蛋白酶的工艺流程为：原始菌株f别离纯化

6、f紫外线诱变f选育菌株别离纯化f亚硝基胍诱变f选育菌株别离纯化f选育菌株生产工艺优化f传代试验f选育菌株f斜面菌种f三角瓶菌种f浅盘菌种 主原料f混料水、无机氮、无机盐f蒸料f冷却f接种f发酵f稳定化处理 f枯燥f粉碎f包装f检测f成品粗酶f抽提f过滤f盐析f沉淀f枯燥粉碎f包装f检测f成品2.2菌种的保藏菌种是从事微生物学以及生命科学研究的根本材料，特别是利用微生物进展有关生产工业，更离不开菌种。所以，菌种保藏是进展微生物学研究和微生物育 种工作的重要组成局部，其任务是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的 优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创

7、造条件，使抱子或菌体的 生长代活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水 平、缺氧状态、枯燥和低温，使菌种处于“休眠状态，抑制其繁殖能力。常用 的菌种保藏方法有：斜面冰箱保藏法、沙土管保藏法、菌丝速冻法、石蜡油封存 法、真空冷冻枯燥保藏法和液氮超低温保藏法。此课题中黑曲霉采用真空冷冻枯燥保藏法，预冻：本实验采用-80C预冻2h后进展枯燥。枯燥过程：第一阶段枯燥.样品温度分别控制在-15 C 14 h, 10 C 10 h,真空度为150 Pa直到样品的水分升华除去90%;第二阶段枯燥。升高板 层温度至20C,迅速蒸发样品中的剩余水分。该过程大约需要10ho将冻干菌存 放于

8、0C冰箱中备用.3. 培养基的配制培养基的类型很多，可以根据组成、状态和用途等进展分类，按照用途可以 分成抱子培养基、种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计主要用到抱 子、种子和发酵培养基这三种类型。3.1活化培养基黑曲霉的活化培养基的配制如下：斜面培养基：蔗糖30g, NaNO3 3 g, MgSO4 0.5 g, KCI 0.5 g FeSQ 0.01 g, K2HPC4 1 g,琼脂 20 g,将上述各组分溶于 1000 mL 水中，121 C灭菌20 min,备用。3.2种子培养基种子培养基是供抱子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长的粗壮成 为活力强的种子。对于种子培养基的

9、营养要求比拟丰富和完全， 氮源和维生素的 含量也比拟高些，浓度以稀薄为好，可以到达较高的溶解氧，供大量菌体生长和 繁殖。黑曲霉的种子培养基为麦芽汁培养基。3.3发酵培养基发酵培养基的要营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、强健，能在比拟短的周期充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意本钱和能耗。黑曲霉3. 350发酵培养基的配方：豆饼粉 3.75%,玉米粉0.625%，鱼粉0.625%,氯化铵1.0%,氯化钙0.5%,磷酸二氢钠0.2%,豆饼石灰水解液10%, pH 5.5。3.4补料培养基黑曲霉3. 350发酵培养基的配方：豆饼粉 37.5%,玉米粉0.625%，

10、鱼粉0.625%,氯化铵1.0%,氯化钙0.5%,磷酸二氢钠0.2%,豆饼石灰水解液10%, pH 5.5。主要加大豆饼粉的量，起补充碳源，氮源和生长因子之用。4 .灭菌生物化学反响过程中，特别是细胞培养过程中，往往要求在没有杂菌污染的 情况下进展，这是由于生物反响系统常含有比拟丰富的营养物质， 因而很容易受 到杂菌的污染，进而产生各种不良的后果：1由于杂菌的污染，使生物化学反响的基质或产物消耗，造成产率下降；2由于杂菌所产生的某些代产物，或污染后发酵液的某些理化性质的改变，使产物的提取变得困难，造成收得率降低或使产品质量下降；3污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败；4污染的杂菌大量繁殖，会改

11、变反响介质的 pH,从而使生物化学反响发生异 常变化；5发生噬菌体污染，微生物细胞被破裂而使生产失败等。4.1灭菌方法所谓灭菌，就是指用物理或化学杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的 过程。常用的灭菌方法有：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤灭 菌等。本设计采用湿热灭菌。4.2培养基的连续灭菌|1丨|;【;图4-1连续灭菌的流程图培养基连续灭菌为在短时间被加热到灭菌温度 130°C 140°C,短时间保温 一般为58min,升降温时间相对较短，可以实现自动控制、提高发酵罐的设 备利用率，蒸汽用量平稳等优点，培养基在短时间被加热到灭菌温度， 短时间保 温后快速冷却

12、，再进入早已灭完菌的发酵罐，这样不但可以节省时间，更重要的 是减少了培养基的破坏率。对补料培养基的灭菌方法跟发酵培养基的灭菌方法一 样都是湿热灭菌，其加热蒸汽压力要求较高，一般不小于0.45MPa。连续灭菌流程如上图。影响灭菌效果的因素有：微生物的种类和数量；培养基的性质、浓度、成分; 灭菌的温度和时间。灭菌原理：对数残留定律对培养基进展湿热灭菌时，培养基中的微生物受 热死亡的速率与残存的微生物数量成正比。4.3空气灭菌此课题以空气为氧源。根据国家药品质量管理规的要求， 生物制品、药品的 生产场地业需要符合空气干净度的要求。获得无菌空气的方法有：辐射灭菌、化 学灭菌、加热灭菌、静电除菌、过滤介

13、质除菌等。过滤介质除菌是目前发酵工业中空气除菌的主要手段，常用的过滤介质有棉花、活性炭或玻璃纤维、有机合成纤维、有机和无机烧结材料等。431过滤除菌流程及设备过滤除菌流程图如图4-1所示:1-粗过滤器；2-压缩机；3-贮罐；4, 6-冷却器；5-旋风别离器；7-丝网除沫器；8-加热器; 9-空气过滤器图4-1空气除菌设备流程图无菌空气的检查无菌检查方法有肉汤培养法、斜面培养法和双碟培养法。这里采用斜面培养 法进展无菌空气的检查，具体方法为：500ml三角瓶装斜面培养基50ml，接种后 置旋转式摇床上，30C下培养24h后观察有无菌落形成。4.4发酵罐的灭菌发酵罐的灭菌可采用空罐灭菌，此处采用空

14、罐灭菌。空罐灭菌是将所有的通 气口都稍微翻开，然后通入水蒸汽，让水蒸汽尽量通过每一个菌落到达灭菌效果。 具体方法是：在121 T灭菌80分钟。5. 种子扩大培养本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。设计流程图如图5-1:斜面锥形瓶二种子罐发酵罐图5-1种子扩大培养流程图5.1种子制备将菌种接种于活化斜面培养基培养，30 °C活化24h。活化后的菌种用生理盐水洗下，转接于摇瓶种子培养基,接种量5%6% 30C培养12h。经摇瓶培养后 的种子，以接种量5%接种于种子罐，30 C培养12h，菌种浓度到达108109个/mL。5.2发酵罐培养将扩大培养后的菌种以5%的接种量接入发酵罐中，发

15、酵温度控制在 30C, 罐压0.5 kg /cm2,发酵过程过流加Na0H溶液控制发酵液pH。根据菌体浓度、pH 决定具体发酵时间为35.5h。发酵过程中采用自动搅拌器，将转速控制在100r/min，使流加碱液与发酵液快速混合均匀。6. 发酵罐的设计省微生物研究所通过改变摇瓶装液量和转速来考察溶氧对黑曲霉菌种的影响。实验结果说明：在250ml的三角瓶中装液量为100ml，转速150r/min酶活 最高，装液量过多或过少，产酶量较低。摇床转速较低时，通气量不够，生长较 慢，产酶量也低。当摇床转速过快时，产酶量也不高，可能是菌丝断裂过度。培 养基中的营养主要被菌体用于自身的生长。此课程设计中选择使

16、用机械搅拌式通风发酵罐。 机械搅拌通风发酵罐是发酵 工厂最常用类型。它是利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合，促使 氧在发酵液中溶解，以保证供应微生物生长繁殖、发酵所需要的氧气。6.1发酵罐的构造机械搅拌式通风发酵罐的主要组成部件有：罐体、搅拌器、轴封、消泡器、 联轴器、中间轴承、空气吹泡管（或空气喷射器）、挡板、冷却装置、人孔以及管 路等。6.2发酵罐罐体的几何尺寸计算1发酵罐普遍H°/D=1.97，而酸性蛋白酶对空气有一定要求，为了使之更大面积的承受氧气，黑曲霉所用发酵罐设计为矮胖形，即：H°/D=1.63，从通风角度讲，空压机为无油润滑一级压缩，出口压力0.3

17、MPa。压缩空气经过约60m米 以上路程才送到发酵车间，管道阻力加上空气过滤器阻力，空气压降厉害，假设 大型发酵罐再设计成瘦高形，势必会增加液柱高度，直接影响到进罐通风管口空 气的压头和流速，假设空压机房贮气筒压头稍有波动产生下降，发酵罐进风口风 速无喷力，对供气量及溶氧带来不利影响。所以大型发酵罐设计成矮胖形可降低 液柱咼度，有利通风溶氧。2. 发酵罐上下封头采用十二块西瓜片拼装而成，顶部中心太阳板直径1800,在现场施工拼装，解决了封头整体成形无法运输的困难。3. 传动部采用卧式电动机通过联轴节带动大型减速箱直接带动搅拌轴，就是 减速箱设一对弧形伞齿轮使进轴作 90°变向用联轴节

18、通过十二根尼龙销棒联接 卧式电动机。既降低了设备安装高度，又给安装维修带来了很大方便，如图：图6-1传动部卧式电动机联轴图四台发酵罐采用二种减速箱，前二台罐为迸口减速箱，减速箱装有一对直齿 轮和一对弧形伞齿轮，构造简单，维修方便，一般只有伞齿轮及进轴、轴承损坏 要维修更新。后二台罐采用国产发电设备厂生产的行星齿轮箱，箱加设一对弧形 伞齿轮使进轴作90°变向，由联轴节与卧式电动机相联。与进口减速箱比，构造 复杂、行星轮坏很难修理。4. 减速箱下传动架上传动轴设计安放一部轴承座 ，装中型普通轴承一粒，轻 型平面受力轴承一粒，轴承上端轴头由夹壳联轴节与减速箱出轴联接。设计少放 一部轴承降低

19、传动架约米的高度，增强了减速箱及电机在罐顶上的稳定性。 罐设 计放二部轴瓦来定位罐轴与上主轴的同心度，上部轴瓦在盘管上方，下部轴瓦安 装在轴端。轴瓦、轴套材质均为铸铁。只要上下轴垂直同心度装得好 ，轴瓦、轴 套半年到一年更换一次。5. 对发酵罐来讲，冷却面积及冷却管的设计非常重要 ，既要考虑排作形式, 又要起到最好冷却效果，还要便于安装维修。设计中采取盘管式，列管式同时采 用的做法，加设盘管组相对来讲好布置，可利用盘管间之间隙当楼梯用，给安装 及今后维修带来很大方便。加设列管组可弥补全用盘管时需用冷却面积的管量放 不下和盘管无档板作用的缺点。考虑罐径大，放热量集中冷却效果一定要好，所以 又在冷

20、却管的合理进出水上做文章，采用快进快出的接收法，就是把盘管列管分 成多组，使冷却水分成多路进多路出，以水在冷却管1.5米/秒停留1分钟来分 组。与发酵液热交换后的热水聚集总管进热水池、再用泵送冷却塔，冷却后的水进冷水池，由泵供送发酵罐进水用。原那么冷却塔循环水量要大于发酵用水量约 倍，保证热水通过冷却塔及时降温到气温夏天满足发酵冷却用水的需要，如图图6-2发酵罐冷却管设计6搅拌桨叶形式及档次直接影响到产酸及搅拌功率，由于罐体矮胖形，罐径 大,，设计采用大桨叶，低转速。底道桨 1900,八弯叶，中道桨小，六弯叶，转 速。所以，采用高通风，大桨叶，低转速搅抖，可降低搅拌功率，同样到达 高产酸的效果

21、。桨叶叶片做成可装拆式，部件拿进罐后组装，用不锈螺栓把叶片锁紧在园盘上，给运输安装带来方便，司时罐顶人孔可缩小，开600即可八万叶轮尺寸如下：叶径 d=0.365D=0.365>5200=1900mm,盘径 d=0.62d=0.62X1900=1175mm,叶片高 h=0.15d=0.15X1900=280mm,叶片弧长 L=0.4d=0.4X1900=760mm,风管：罐压：0.02MPa,罐温：35C,培养基量：最大通风比1: 0.38时120m3。液柱高度：H=7.3米，风管出口压 P=0.193MPa贮气筒压头P供气最低压力：空气输送管道阻力0.02MPa,二级空气过滤器阻力 0

22、.04MPa。故 P=0.02+0.04+0.193=0.253MPa绝对压力7. 进风管采用盘管式管径根据通风量计算，在盘管上放二付不锈法兰，便 于安装及今后清洗，盘管径等于低道桨径。盘管放在底道桨叶片下面，盘管下方开三排小孔，二排成45°角，小孔径O46,穿插排列、这样有利于罐底部液体 的搅拌和通风，且不易被固体物堵塞，孔数根据盘管截面积计算，小孔总面积镇 盘管截面积，使风通过各个小孔时有产生喷力。8. 罐体支座设计成由六根园柱脚支承整台罐体放在盆形的水泥墩上 ，放料管 从罐底中接出斜穿过水泥墩壁排水孔引接到打料泵送等电点提取。 防止了裙座造 成罐底难清洗，死角多，长杂菌、难消毒

23、的缺点。整台罐底下通风好，照，清洗消 毒非常方便。9. 利用下轴瓦座筒形架下部四孔封上 2目不锈钢网来捕集罐螺褚全、螺母等另部件的脱落回收，给查罐时及时提供维修信息，保证了放料阀、打料泵不易损坏,使用平安可靠性。6.3发酵罐壁厚罐体壁厚8i=pD/(2(T -p)+C6-2式6-2中：p耐受压强取0.25MPa书旱缝系数，双面焊取0.8，无缝焊取1.0c殳计温度下的许用应力不锈钢焊接压力容器许用应力为150C ,137 MPaJC腐蚀裕度，当 卜C<10mm时，C=3mm解得罐体壁厚汩pD/(2 c -p)+C=0.25Xl500/2X137X).8-0.25+3=4. 7 mm取整为3

24、=5 mm封头壁厚+C3=pDy/(2 c )6-3式6-3中：p耐受压强取0.25MPay开孔系数，取2.3书焊缝系数，双面焊取0.8，无缝焊取1.0c设计温度下的许用应力不锈钢焊接压力容器许用应力为150°C ,137 MPaC腐蚀裕度，当 卜C<10mm时，C=3mm解得封头壁厚浒pDy/(2(T )+C=0.25X1500>2.32X137X).8+3=6.9 mm取整为3=7 mm6.4发酵罐个数确实定年产量为1000吨，一年有300个工作日，黑曲霉发酵周期 T=48h=2d,其中 清理发酵罐1天，产量为50 g/L,罐压0.5 kg/cm 2。查相关资料有：酸

25、性蛋白酶 发酵周期48h,清理及维修发酵罐时间为1天，那么发酵总时间为3天，产量为 50g/L,灭菌时间为5h，发酵液预处理收率约为90%,提取时的收率约为95%,浓 缩枯燥收率为90%，装料系数为60%一年需放罐的次数：300-3=100次每批次产酸性蛋白酶1000/100=10吨总提取率为：90%>95%>90%=76.95%假设用一台发酵罐，那么发酵罐的体积V=10X1000/76.95%60%/50=433.2 m3选发酵罐的公称体积为200 m3,那么需要发酵罐3个，那么购置4台发酵 罐，一台备用。6.5发酵罐附属构造的计算搅拌器搅拌桨叶形式及档次直接影响到产酸及搅拌功率

26、，由于罐体矮胖形，罐径大,，设计采用大桨叶，低转速。底道桨 1900,八弯叶，中道桨小，六弯叶，转 速。所以，采用高通风，大桨叶，低转速搅抖，可降低搅拌功率，同样到达 高产酸的效果。桨叶叶片做成可装拆式，部件拿进罐后组装，用不锈螺栓把叶片 锁紧在园盘上，给运输安装带来方便，司时罐顶人孔可缩小，开600即可。八万叶轮尺寸如下：叶径 d=0.365D=0.365>5200=1900mm,盘径 d=0.62d=0.62X1900=1175mm,叶片高 h=0.15d=0.15X1900=280mm,叶片弧长 L=0.4d=0.4X1900=760mm,风管：罐压：0.02MPa,罐温：35C,

27、培养基量：最大通风比1: 0.38时120m3。液柱高度：H=7.3米，风管出口压 P=0.193MPa贮气筒压头P供气最低压力：空气输送管道阻力0.02MPa,二级空气过滤器阻力 0.04MPa。故 P=0.02+0.04+0.193=0.253MPa绝对压力手孔、视镜、温度计和工艺接收手孔：由？平盖手孔？(/T589-1979)或？板式平焊法兰手孔？(HG21529-1995)选 用光滑密封面的平盖手孔 APNI, DN250 /T589-1979视镜：由标准？压力容器视镜？(HG/T21619-21620-1986或?组合式视 镜？(HG21505-1992)选用碳钢带颈视镜 IPNI,

28、 DN80(HG/T21619-21620-1986)温度计：加强套管温度计的选用可以参考生产厂家的产品目录， 这里取公称 长度1 430 mm,配凸面板式平焊管法兰 PNO.6 MPa DN65, HG20593-1997(板 式平焊钢制管法兰？)。工艺接收：(?钢制管法兰型式、参数(欧洲体系)?)。进料管口采用 57X3.5无缝钢管，配法兰 PNo.6, DN50, HG20592-1997出 料管口采用 76X4无缝钢管，配法兰 PNo.6, DN65, HG20592-1997 加热蒸汽进口管采用 38X3.5无缝钢管，配法兰PNO. 6, DN32,HG20592-1997冷凝液出口

29、管和压力表接收都选用32X3.5无缝钢管，配法兰PNO.6, DN25,HG20592-1997平安阀接收采用45X 3.5无缝钢管，配法兰 PNO.6, DN40, HG20592-19976.6发酵设备一览表通过设备的工艺设计计算，可列出淀粉酶生产的所有设备，如表4-1表6-61000t/a酸性蛋白酶生产车间设备一览表序号设备名称台数规格与型号材料1发酵罐6公称容积 200m3,R 5200mmA3钢2种子罐3公称容积5m3； 1400mmA3钢3种子罐分过滤器3|j-_|40mmA3钢4发酵罐分过滤器6300mmA3钢5连消塔1亘350 X 2600mmA3钢6维持罐1V=4m3A3钢7

30、喷淋冷却器1F=171.9m2A3钢8螺旋板换热器1F=20m2A3钢9预处理罐3V=100m3A3钢10硅藻土过滤机3WK500-AA3钢11真空浓缩锅1SZN1200A3钢12盐析罐1V=50m3A3钢13板框压滤机5XYJ800A3钢14物料泵4GNF64X 4机体铸铁15清水泵4JL X 20-36-G机体铸铁16空气压缩机34L-40/2-3.2A3钢17空气贮罐11300mmA3钢18油水别离器11 600mmA3钢19丝网别离器1目.1 120mmA3钢20热交换器4JM220QFA3钢7. 发酵车间的物料衡算7.1工艺技术指标及根底数据主要技术指标见表7-1表7-1黑曲霉主要技

31、术指标指标名称单位指标数指标名称单位指标数生产规模（G）t/a1000产品纯度%95年生产天数（D）d/a300接种量%5产品质量（U）IU/mg50发酵罐装料系数（n）%60倒罐率（n）%2.0放罐发酵单位（Um）IU/ml8000发酵周期（T）d3提取总收率（n）%77培养基g/L黑曲霉3. 350发酵培养基的配方：豆饼粉 3.75%,玉米粉0.625%，鱼粉 0.625% ,氯化铵1.0%，氯化钙0.5%，磷酸二氢钠0.2%，豆饼石灰水解液10%, pH 5.5.菌种培养基的配置：查氏培养基 NaNO3 2g, KHPO4 1g KCI 0.5g, MgSO4 5g, FeSO4 0.0

32、1g 蔗糖 30g,琼脂 15g，水 1000ml, pH 自然。7.2发酵车间的物料衡算放罐成熟发酵液量成熟发酵液放罐单位为Um=8000IU/mL,生产G=1000t酸性蛋白酶发酵液量为：V0=(GXU)/(UmX 2>98%>95%)7-1 式7-1中：G生产规模U产品质量Um 放罐发酵单位95%产品的纯度98%除去倒罐率2%后的发酵成功率放罐成熟发酵液量V0分为三局部组成底料V1 =156960X84%=131846.4*种液量V2=156960X5%=7848n?补料液V3=156960X11%=17265.6m?培养基各组分耗用量豆饼粉耗用量：m仁3.75% X5696

33、0=5886玉米粉耗用量：m2=0.625% X56960=981,鱼粉耗用量：m3=0.625% X56960=981氯化铵耗用量：m4=1.0% X56960=1569.6氯化钙耗用量：m5=0.5% X56960=7784.8磷酸二氢钠耗用量：m6=0.2% X156960=313.92豆饼石灰水解液耗用量：m7=10% X15696O=15696pH 5.57.3物料衡算表表7-31000t/a黑曲霉发酵生产物料衡算表物料名称1000 t/a黑曲霉生产的物料量每周期物料量豆饼粉/ k5886588.6玉米粉/ k98198.1鱼粉/ k98198.1氯化铵/ kk1569.6156.9

34、6氯化钙k7784.8778.48磷酸二氢钠/k313.9231.392豆饼石灰水解液/ k15696156.96HCI据情况而定据情况而定7.4简单的物料衡算放罐发酵单位Um=8000IU/mL,折合成产量为50g/L，折合系数为k=1.6X105 IU/g。本设计采用3个发酵罐，每个为200m3,酸性蛋白酶的产量50g/L，提炼总 收率为95%,装料系数为60%，浓缩枯燥收率为90%,产品纯度为95%,那么： 每个发酵罐在一个发酵周期中酸性蛋白酶的产量为：200 X50 >95%>60%,90%x95%=4873.5 kg那么3个发酵罐一年的总产量为：4873.5X300/3X

35、3=1462050 kg =1462.05t在后期损耗合理的情况下，故符合年产1000t的生产要求。&发酵过程的工艺控制8.1发酵过程的补料策略中间补料是在发酵过程中补充某些营养物料、 水或产酶促进剂，以满足微生 物的代活动和产酶需要。由于黑曲霉发酵周期短，故采用补料分批发酵。在补料 分批发酵中，初始发酵培养基中玉米粉浓度为 3.75g/100ml,从发酵第3h开场恒 速200L/h补入原培养液，其中玉米粉浓度变为原料液十倍 37.5g/100ml，每 隔1h取样一次，不适宜处加以微调。8.2发酵过程pH值的控制各种微生物需要在一定的pH环境中方能正常生长繁殖。黑曲霉酸性蛋白酶的最适p

36、H是2.52.7,但黑曲霉3. 350发酵产生酸性蛋 白酶培养基的最初浓度应调节为 4.55.5左右。一般控制在5.5。8.3发酵过程温度的控制温度对微生物的生长、产物的合成和代调节有重要作用。温度变化一方面影 响各种酶反响的速率和蛋白的性质，另一方面影响发酵液的物理性质。不同的菌 种有着不同的最适温度。黑曲霉发酵温度控制在 30 C左右最适宜。8.4发酵过程溶氧的控制液体深层培养局部微生物在合成蛋白酶时需要强烈搅拌通风。 氧是黑曲霉生 物合成酸性蛋白酶必须的，通风量较大对产酸性蛋白酶有利，通风气量缺乏对黑 曲霉菌丝体的生长无明显影响，但对酶产量有严重的影响，通风量对产酶的影响 在培养前期更为

37、明显，短暂停顿通风搅拌会导致酶产量急剧下降。 因此发酵工程 中应控制好通风量，024h为1:0.25,2448h为1:0.5,48h至完毕为1:1.0,发酵周 期为72h左右。8.5发酵过程氧载体的控制在发酵过程中，在发酵培养基中参加正十二烷、全氟化碳，液态烷烃（为1216碳直链烷烃混合物）等氧载体，使培养基中氧传递速度加快，产生气泡少， 剪切力小，能明显提高菌株产酸性蛋白酶的量。8.6发酵过程染菌的控制在工业发酵中，染菌轻那么影响产品的质和量、重那么倒罐或停产、影响工 厂效益。因此要严格要求无菌操作，种子灭菌要彻底，净化空气设备，操作要慎 重，设备灭菌要彻底。假设在前期染菌，应重新灭菌；中期

38、染菌，应偏离杂菌生 长条件；后期染菌，可提前或及时放罐。可能出现的异常发酵现象：1培养基变稀：可能是噬菌体污染或营养成分缺乏，也可能是设备渗漏 或火菌完成后冷凝水过多；2培养基过浓：会抑制微生物的生长，考虑可能是污水污染、灭菌时水 分散失过多，或微生物生长速率过慢；3耗糖慢：可能是环境问题，或种子生长能力降低，检测种子是否衰退， 发酵条件是否适宜，以及营养成分是否全面，尤其注意缺磷；4pH值不正常：用缓冲对来调节，检查是否染菌，碳氮比是否适宜；5生长缓慢：最可能的原因就是营养成分缺乏或细胞本身出现问题。9. 下游加工下游加工过程是生物工程的一个组成局部，是生物化工产品通过微生物发酵 过程、酶反