反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆及膀胱中阿霉素的浓度

1、反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆及膀胱中阿霉素的浓度张宏文 钱立新 王蔚青 钱 靖 欧 宁 邵志高南京医科大学第一附属医院 (南京 210029摘 要 :目的 建立测定血浆及膀胱组织中阿霉素含量的反相高效液相色谱法 。初步应用于膀胱癌患者膀胱内灌注阿 霉素预防膀胱肿瘤术后复发的疗效观察 。 方法 血浆中样品用二氯甲烷 2异丙醇混合液提取 , 膀胱组织制成匀浆后经二氯甲 烷 2异丙醇混合液提取 ,Hypersil ODS 柱 (416mm 200mm ,10m 为分析柱 , 甲醇 20101m ol L -1磷酸二氢钾 2冰醋酸 (8515 015 为流动相 , 检测波长为 E 475nm X

2、、 E 545nmM , 以柔红霉素为内标 。 结果 血浆及膀胱组织中阿霉素的线性范围分别为 10300ng ml -1和 011110g g -1, 日内 、日间误差 RSD 均小于 10%, 平均回收率分别为 104139%和 94152%。 结论 本法测定血浆及膀 胱组织中阿霉素含量准确 、 简便 , 适用于阿霉素药代动力学的研究 。关键词 :高效液相色谱法 ; 阿霉素 ; 血药浓度 ; 膀胱组织in H um an Plasm a and B ladderHPLC with Fluorescence DetectorZHANG H ong 2w en , QIAN Li 2xin ,

3、WANG Wei 2qing , QIAN Jing ,Ou Ning , SHAO Zhi 2gaoThe Fir st Affiliated Hospital with Nanjing Medical Univer sity (Nanjing 210029, China ABSTRACT :AIM T o establish an analytical method for the determination of adriamycin in human plasma and bladder by HP LC with fluorescence detector. METH OD Adri

4、amycin in plasma was extracted with mixture of dichloromethane and is opropyl alcohol. The ho 2m ogenate tissues sam ples were plunged into dichloromethane is opropyl alcohol and adriamycin was extracted. A Hypersil ODS column was usedwith a m obile phase of methanol 20101m ol L -1phosphate bu ffer

5、s olution 2acetic acid (85 15 015 ,the detective wavelength was E 475nm X,E 545nmM and daunorubicin was used as the internal standard. RESU LTS The calibration curve was linear within the range of 10300ng ml -1,and 011110g g -1in plasma and bladder ,respectively. The inter 2day and intra 2day RSD wa

6、s less than 10%,the recovery was 104139%and 94152%respectively. CONC L USION The method is sim ple with high sensitivity and g ood precision and has proved to be suitable for phar 2macokinetic studies of in adriamycin.KE Y WOR DS :HP LC ;Adriamycin ;Plasma concentration ;Bladder 阿霉素 (Adriamycin ,ADM

7、 是一种抗肿瘤谱广 、 活性强 、 临床上广泛使用的蒽环类细胞毒抗生素 , 但 它具有明显的毒副作用 , 最显著的是心脏毒性和骨 髓抑制 1。膀胱癌是泌尿生殖系统中最常见的肿 瘤 , 且复发率高 , 局部化疗成为重要的治疗和防止复 发的方法 ; 而异博定作为增效剂可使化疗达到更为 理想的效果 2。 本研究建立的反相高效液相色谱法 测定血浆及膀胱组织中阿霉素含量的方法将用于研 究异博定对阿霉素的增效作用 。1 仪器与试药Waters 液相色谱仪 (包括 474荧光检测器 ,515泵 ,Rheodyne 7725i 进样阀 ; 上海分析仪器厂 ;N2000色谱工作站 (浙江大学仪器厂 ; 匀浆器

8、; 8022离心 机 。阿霉素对照品 (中国药品生物制品检定所 , 标示 量 9613% ; 内标 :柔红霉素 (西安制药厂 。乙腈 、 甲醇均为色谱纯 (上海化学试剂厂 ; 冰醋4 江苏药学与临床研究 2006年第 14卷第 1期通讯作者 T el :02528371883626362酸 、 磷酸二氢钾 、 异丙醇均为分析纯 。 2 方 法 211 色谱条件色谱柱 :Hypersil ODS 柱 (415nm 200nm , 10m ; 流动相 :甲醇 20101m ol ml -1磷酸氢二钾 2冰醋酸 (85 15 015 pH 415; 流速 :1ml min -1; 检测波长 :E 4

9、75nm X、 E 545nm M ; 进样量 :20l 。 212 对照品溶液及内标溶液的配制精密称取阿霉素 0100501g 于 10ml 量瓶中 , 用甲醇溶解并稀释至刻度 , 摇匀 , 精密量取 012ml 于 10ml 量瓶中 , 以甲醇溶解并稀释至刻度 , 配制 10102g ml -1阿霉素对照品溶液 。甲醇作为溶剂进一步 稀释 , 制得不同浓度系列对照品溶液 。精密称取内 标柔红霉素约 10mg , 置于 100ml 量瓶中 , 解并稀释至刻度 , , 取 110ml 中 , , -溶液 。 4。 213 样品处理血浆样品预处理 离心试管加入肝素抗凝血浆110ml , 精密加入

10、 10g ml -1内标溶液 20l , 混匀 ,加二氯甲烷 2异丙醇 (9 1 5ml , 涡旋混匀 2min ,4000r min -1离心 15min , 取 4ml 有机层于 40 水浴挥干 , 残渣用甲醇 50l 溶解 , 取 20l , 作 HP LC 测定 。膀胱组织样品预处理 取膀胱组织 015g , 加磷 酸盐缓冲溶液 (pH 718 110ml , 匀浆器匀浆 , 加内标 溶液 (10g ml -1 20l , 加二氯甲烷 2异丙醇 (9 1 5ml , 在快速混合器上旋振 2min 、 以 4000r min -1离心 15min , 取 4ml 有机层于 40 水浴挥干

11、 , 残渣用甲醇 50l 溶解 , 进样 20l , 作 HP LC 测定 。 3 结 果 3. 1 按 项 和内标的组织 , 作 HP LC 分析 , 所得色谱见图 1。在上述色谱条件下 , 阿霉素与内标分离 , 空白血 浆和膀胱组织对样品测定无干扰 , 故本法具有良好 的专属性 。图 1 血浆及膀胱组织中阿霉素 HP LC 色谱图A :空白血浆 ;B :标准含药血浆 ;C :空白膀胱组织 ;D :标准含药膀胱组织 (阿霉素 t R =8142m in ; 内标 t R =10134m in 3. 2 标准曲线于离心试管中加入空白血浆 1ml , 加入不同量的阿霉素标准溶液 , 使阿霉素浓度

12、分别为 10、 20、 50、 100、 200、 300ng ml -1, 按 “ 血浆样品处理” 项下操作 , 记录内标及样品峰面积 A i 和 A s 。以阿霉素及内标 峰面积之比 A s /A i 为纵坐标 (Y , 血药浓度为横坐 标 (X 作回归分析 。 回归方程为 :Y =010042+010038X (r =019994, n =5 , 阿霉 素最低定量浓度为 5ng ml -1。取膀胱组织 015g 加入一系列浓度的盐酸阿霉素标准液 , 使组织中阿霉素浓度分别为 011、 012、014、 016、 110g g -1, 按 “膀胱组织预处理” 项下操 作 , 记录内标及样品

13、峰面积 A i 和 A s 。以阿霉素及 内标峰面积之比 A s /A i 为纵坐标 (Y , 血药浓度为 横坐标 (X 作回归分析 。 回归方程为 :Y =010038+010854X (r =019982, n =5 。 313 精密度试验按 “ 312” 项方法配制 300、 100、 20ng ml -1高 、 中 、 低 3种浓度的含药血浆 , 按 “血浆样品预处理” 项下 步骤作 1天内和连续 5天的测定 , 记录峰面积 。结5 江苏药学与临床研究 2006年第 14卷第 1期果见表 1。表 1 血浆中阿霉素的日内和日间变异 (n =5浓度 /ng m l -1日内A /A (x

14、s RSD (%日间125710877698 取膀胱组织 015g 制成阿霉素浓度分别为 011、014、 110g g -1的样品 , 按“ 膀胱组织预处理” 项下操 作 ,1日内和连续 5天测定 , 结果见表 2。表 2 膀胱组织中阿霉素的日内和日间变异 (n =5浓度 /ng m l -1日内A A (x s RSD (%日间11938401009414011964501105127314 回收率测定、 300ml -1, 11410g g -1的样品 , 按 “ 和 “膀胱组织预处理” 项下操作 , 结果见表 3和表 4。表 3 血浆样品中阿霉素的回收率 (n =5加入量 /ng m

15、l-1回收率RSD (%9910761967103表 4 膀胱组织中阿霉素回收率 (n =5加入量 /ng m l -1回收率x sRSD (%9752449460315 最低检测限和最低检测浓度按信噪比 3倍计算 , 本法血浆及膀胱组织中最低检测浓度分别为 5ng ml -1和 0105g g -1。 4 讨 论参考文献 3, 在流动相配比中 , 增加了甲醇的含量 , 使 ADM 的保留时间前移 , 吸收增加 , 提高了方法 的灵敏度 。 用二氯甲烷 2异丙醇 (9 1 的混合液提取 血浆和膀胱组织中阿霉素较文献报道的氯仿 2甲醇 (4 1 的混合液提取 , 干扰峰少 , 混合时间短 , 提

16、取效 率高 。 采用内标法 , 克服了在阿霉素提取过程中可 能引起的操作误差和测定时存在的不稳定因素 。 用 , 因而为了测出微 , , , 并减少 ADM 的破坏 , 加入磷酸盐缓 冲液的量要适宜 (过多过少均不利于 ADM 的提取 。 本方法对文献的方法进行了改进 , 改进后的方法具 有灵敏度高 、 快速简便的优点 , 为研究膀胱灌注术后 阿霉素在体内的药物浓度及异博定对 ADM 的增效 作用 , 提供了方法学基础 。有关该方法的临床应用 将另文发表 。参 考 文 献1 陈新谦 , 金有豫 , 汤 光主编 . 新编药物学 M.第 15版 , 北京 :人民卫生出版社 ,2003:67867912 王洪亮 , 赵忠文 , 姜凤鸣 . 异博定对塞替哌及阿霉素在人膀胱癌细胞株体外化疗的增效作用 J.白求恩医科大学学报 ,1997, 23(5 :51751913 何素梅 , 魏树礼 , 吴传斌 , 等 . 反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆或肝组织中阿霉素含量 J.药物分析杂志 ,1994, 14(4 :8111 信 息国家食品药品监督管理局听证规则 (试行 (局令 23号 发布 为规范国家食品药品监督管理局行政许可 、 行政处罚 、 行政立法 、 行政决策等行政行为 , 保护公民 、 法人和其他组织的合法权益 ,2005年 12月