第二章(6)植物体细胞杂交技术.doc

1、第二章(6)植物体细胞杂交技术课题植物体细胞杂交技术课程1了解植物体细胞杂交的意义教学2掌握植物体细胞杂交的过程3掌握PEG融合处理目标教学重点植物体细胞杂交的过程教学难点PEG融合处理课型课堂讲授授课时数3使用教具多媒体、八、-刖言有性杂交是植物遗传改良的一种传统手段，它的作用空间主要限于种内的品种之间。种及种以上分类单位之间的杂交，例如种间或属间杂交，则常常遭遇有性不亲和性障碍。在无性繁殖植物和性不育植物中，如在马铃薯、甘薯、木薯、甘蔗和香蕉中，更是难以通过有性 杂交进行遗传改 良。因此，建立在原生质体全能性基础上的体细胞杂交和胞质杂交技术，对于植物的遗传改良具有重要的 意义。1 体细胞杂

2、交(somatic hybridization)在离体条件下通过两个亲本体细胞原生质体的融合以及随后将融合产物培养成杂种植株的过程。1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是第一个植物体细胞杂种。2体细胞杂交步骤2.1原生质体的制备2.2原生质体的融合2.2.1自发融合在酶解细胞壁的过程中，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体（homokaryon）,每个同核体包含240个核。形成的原因：由不同细胞间胞间连丝的扩展和粘连造成的。减少自发融合的措施：在用酶液处理之 前，使细胞受到强烈的质壁分离药物的作用，切断胞间连丝。2.2.2 诱发融合2.2.2.1 NaNO3

3、处理1909年，Kuster在一个发生了质壁分离的表皮细胞中，低渗NaNO3溶液可以引起2个亚原生质体的融合。缺点：异核体（heterokaryon）形成频率不高。2.2.2.2高PH-高浓度钙离子处理1973年，Keller和Melchers r用强碱性（PH10.5）的高浓度钙离子（50mmol丄）溶液在37C下处理约30min,两个品系的烟草叶肉原生质体很容易融合。但对于有些原生质体系统，这样高的PH值是有毒的。2.2.2.3 PEG （聚乙二醇）处理PEG的作用机理：Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的 水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体

4、之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而 促使原生质体的融合。另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。PEG作为融合剂的优点： 异核体形成的频率高，可重复性强，对大多数细胞低毒； 形成双核异核体的频率高。据Burgess和Flenming （1974年）报道：在37C下用高钙离子的强碱性溶液处理时，产生的聚 集体很大，每个包含很大原生质体。以PEG为融合剂时，多数聚集体包含23个原生质体。图1融合基本过程细胞a细胞B用月兑糜醸处理除去细胞壁原生顏体A更丰质体B混合加入约403&的聚乙二醇原生质体笈生融合涂在能使细胞壁再生的培养基上挂出詢落彩印到

5、选择性培养基上1P检岀車组合子的制落注意事项： PEG 的分子量(MW 1500-6000) 酶溶液浓度 原生质体来源 PEG的稀释逐步进行 在PEG溶液中，加入钙离子可以提高融合效率) 高温(3537C) 4%5% (V/V )的原生质体悬浮液 所用酶种类和浓度，一般用崩溃酶。 材料预培养 融合地点(在离心管中，在小液滴中)(11)在PEG溶液中的保温时间太长会降低异核体形成频率。2.224电融合将一定密度的原生质体悬浮液置于一个融合小室中，小室两端有电极，在不均匀的交变电场的作用下，原生质体彼此靠近，在两个电极间排列成串珠状。这时，如果有足够强度的电脉冲，就可以使质膜发生可逆性电击穿，从而

6、导致融合。2.2.3融合产物的细胞学在膜融合以后的数小时内，2个细胞的细胞质混在一起，形成一个双核异核体。过程中，二者的染色体被一个共同的纺锤体所牵引，在有丝分裂末期形成两个杂种子细胞。最终分化出体 细胞杂种，其核内具有双亲的染色体组。在双亲亲缘关系比较远的杂种细胞中，两个来源不同的染色体组常常不能完全结合在一起。在动物 体细胞杂种细胞系中，已知双亲之一的染色体会逐渐消除，在植物中也看到这种现象。2.3杂种细胞选择2.3.1根据物理特性选择2.3.1.1根据可见标志选择主要用于非绿色原生质体与含有叶绿体的原生质体的融合。2.3.1.2根据荧光标记选择将2种原生质体群体分别用不同的荧光染料标记，

7、然后通过荧光显微镜鉴别异核体。2.3.1.3低密度植板选择2.3.2突变互补选择2.3.2.1隐性突变互补选择2.3.2.2显性抗性互补选择2.3.2.3隐性突变与野生型互补选择2.3.2.4显隐性双突变体选择2.3.3根据生长和再生能力的差别选择2.3.3.1根据愈伤组织生长差别选择在曼陀罗和烟草种间体细胞杂交以及在小麦和某些其他禾谷类植物属间体细胞杂交中，发现杂种愈 伤组织表现生长优势现象，因此融合处理后只要挑选生长快、长的最大的愈伤组织，就会从中分化出体 细胞杂种。2.3.3.2植株再生能力的差别选择不同来源的原生质体分化再生植株的能力不同。在体细胞杂交中，只 要有一个亲本的原生质体能够

8、再生植株，融合产生的杂种细胞就能再生植株。2.3.3.3根据生长和分化对培养基要求的差别选择不同来源的原生质体对培养基成分和激素的要求不同。设计的培养基只有杂种细胞能够生长。2.4杂种细胞培养2.5由愈伤组织再生植株2.6杂种植株的鉴定2.6.1形态和育性鉴定 株型、叶形、花形，茎、叶茸毛的有无，或多或少有双亲的特点。育性取决于双亲亲缘关系的远近，杂种或是育性很低，或是完全不育。2.6.2细胞学和分子细胞学鉴定通过确定杂种染色体数和染色体形态2.6.3生化鉴定同工酶谱分析法：将体细胞杂种的同工酶谱与其双亲的酶谱比较：杂种植株的酶谱可能是双亲酶谱带的总和；可能只 岀现双亲的部分酶带；或缺少双亲的

9、某些酶谱而出现新的谱带。2.6.4分子生物学鉴定RAPD （Random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性 DNA）AFLP （ Amplified fragment length polymorphism ,扩增片段长度多态性）SRAP （sequence- related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性）SSR （Simple sequenee repeat,简单序列 重复）3体细胞杂种在农业生产上的应用3.1对无性繁殖植物或性不育植物进行遗传重组对2个不能进行有性繁殖的物种之间实现遗传重组,体细胞融合目前看来是唯一途径。性不育植物（单倍体、三倍体和非整倍体），融合后产生可育的二倍体或多倍体。3.2克服有性不亲和性障碍由于存在不亲和障碍，种间或属间有性杂交虽能进行，但难以产生杂种，而通过体细胞 融合,有可能 突破有性杂交的这种局限性。3.3细胞质遗传性状的转移细胞质雄性不育（ems）性状的