生物大分子与有机小分子荧光探针相互作用的静态荧光猝灭理论及实验研究

1、第45卷第3期2006年5月厦门大学学报(自然科学版)JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)Vol.45No.3May2006生物大分子与有机小分子荧光探针相互作用的静态荧光猝灭理论及实验研究张建荣,郭祥群,赵一兵3(厦门大学化学化工学院化学系,现代分析科学教育部重点实验室,福建厦门361005)摘要:现有的荧光猝灭理论的应用混淆了猝灭剂的平衡浓度Q与初始浓度Q0之间的关系.基于这一问题,本文探讨了生物大分子与有机物小分子探针之间相互作用的静态荧光猝灭理论,推导了相关的表观结合常数K和结合位点数n的数学表达式,及其相关的定量测定关系式.推导结果表明,

2、荧光体的荧光强度与荧光体和猝灭剂之间的相对浓度有直接的关系,在猝灭剂的初始浓度Q0远小于荧光体的初始浓度P0时,4F与猝灭剂初始浓度Q0在一定浓度范围内呈正比;而在猝灭剂的初始浓度Q0远大于荧光体的初始浓度P0时,lgF与lgQ0呈正比.验验证,结果表明,理论推导与实验结果相符,生物大分子的更加科学的方法,.关键词:生物大分子;有机物小分子;荧光猝灭;理论中图分类号:O657.3文献标识码:A:20479(2006)0320365205灭理论,1,2,小分子之间的荧:猝灭剂(Q)与荧光体(P)反应生成1:1的配合物,且生成的配合物(P2Q)不发荧光,因此其推导结果=1+KQ对大F5=lgKA+

3、nlgQ,FF0-FnKPt4,lg6=+等.这些关系式虽然在推导时考虑了nnKQ生物大分子与小分子之间相互作用时结合比为1n的关系,但仍忽略了猝灭剂的平衡浓度Q与初始浓度Q0的差异,因而在应用时是不科学的.鉴于上面存在的问题,本文在理论上推导了生物大分子猝灭有机物小分子荧光探针荧光的相互关系,并进行了实验验证.多数小分子间的相互作用是适用的,但对于小分子与生物大分子间的相互作用就不再适用,原因是生物大分子与荧光体小分子作用时,它们的结合往往不再是简单的1:1关系,而是一个生物大分子可结合n个荧光体小分子,而且在一些情况下,随着生物大分子和小分子相对浓度的变化,结合比是变化的.同时需要指出的是

4、,上式中的Q为反应后猝灭剂的平衡浓度,而非猝灭剂的初始浓度Q0,由于实际测定时初始浓度Q0是已知的,平衡浓度Q是未知的,故上式不能用作定量测定的依据,而实际测定时混淆了Q0与Q的差异,以Q0替代Q是不科学的.近几年来,随着研究者对生物大分子的研究,已经意识到结合位点的问题,在文献中也报导了各种各样的关系式,如:3F0-F收稿日期:2005205212作者简介:张建荣(1981-),女,硕士研究生.3通讯作者:ybzhao1实验部分1.1仪器与试剂RF25301荧光分光光度计(Shimadzu.Japan).MettlerToledo3202S型pH计(上海).鱼精子脱氧核糖核酸(DNA,Fis

5、hTestes,AMRESCO分装,上海生工生物工程技术有限公司)溶液:配制时将准确称量的适量试剂直接溶解在水中,定容至刻度,4储存.亚甲基蓝(MB,生物染色剂,上海试剂三厂)溶液:配制时将准确称量的适量试剂直接溶解在水中,配制成1.0×10-3mol/L的储备液,使用时逐级稀释.邻菲啰啉(phen,广州化学试剂分公司)溶液:配制时将准确称量的适量试剂溶于5mL无水乙醇中,然后用去离子水定容至刻度,配成1.0×10-2mol/L的=F0+KLBF0cq,F=F0-366厦门大学学报(自然科学版)2006年储备液,4储存,使用时逐级稀释.环丙沙星(CPFX,化学对照品,中国药

6、品生物制品鉴定所)溶液:配制时将准确称量的适量试剂用0.1mol/L的盐酸溶解,然后用去离子水定容,配成1.0×10-3mol/L的储备液,4储存,使用时逐级稀释.罗丹明B(RhB,上海试剂三厂)溶液和L2色氨酸(L2Trp,AMRESCO分装,上海生工生物工程技术有限公司)溶液的配制方法同MB.三羟甲基氨基甲烷(Tris)2HCl缓冲液:0.05mol/L.荧光测定均在室温进行,所有化学试剂均为分析纯,所用生化试剂未经进一步纯化,水为去离子石英亚沸水.值为浓度为P的有机物小分子外源荧光探针的荧光强度,即F=kP(4)(5)(6)由浓度关系可得:P0=P+nPn-QQ0=Q+Pn-Q

7、由式(3)(6)可得:Pn-Q=n=nk(7)Q=Q0-Pn-Q=Q0-P=knk(8)(9)1.2实验方法在10mL比色管中按顺序依次加入1.5mL0.05mol/LTris2HCl缓冲液,一定体积、一定浓度的MB(phen、CPFX、RhB、L2Trp)标准溶液,用去离子石英亚沸水定容至10mL,然后在荧光计上测定无DNA共存时MB(phen、CPFX、RhB、L2Trp)度F0.同样,在10mLmL0.05mol/LTris2,积、一定浓度的MB(phen、CPFX2Trp)标准溶液,再加入待测的DNA溶液,反应10分钟后用去离子石英亚沸水定容至10mL,然后在荧光计上测定有DNA共存时

8、MB(phen、CPFX、RhB、L2Trp)的特征荧光强度F.荧光激发和发射狭缝均为5nm,1cm×1cm液池.把公式(7)(9)代入(2)得:K=PQ0nk=nknnk=nFnkQ0-(10)(1)当猝灭剂的浓度远小于荧光体的浓度,即Q0P0时在Q0P0的情况下,如果K值大到足以使生物大分子与荧光探针小分子的相互作用有意义,而且猝灭剂生物大分子的初始浓度Q0相对较小,则可认为猝灭剂完全反应,此时猝灭剂生物大分子各作用位点均与荧光探针小分子结合,在此前提下有:Q0Pn-Q(11)2结果与讨论2.1理论推导有机小分子荧光探针包括吖啶类、罗丹明类、荧光素类染料等,其与生物大分子的荧光猝

9、灭反应表达式为:(1)nP+QPn-Q式中P为外源荧光探针,Q为生物大分子猝灭剂,讨论的前提是外源荧光探针与生物大分子作用位点结合后荧光完全被猝灭,则反应的表观结合常数表示为:(2)K=PnQ反应前体系的荧光强度值为浓度为P0的有机物小分子外源荧光探针的荧光强度,即(3)F0=kP0式中k为荧光探针的灵敏度参数,即探针本身的荧光值与其浓度线性关系的斜率.反应后体系的荧光强度则:P0-P=nPn-Q=nQ0即:-=nQ0kkF=nkQ0(12)在公式(12)中,由于k是定值,又由于Q0P0,可认为n近似为常数,则F与Q0在一定的浓度范围内成线性关系.(2)当猝灭剂的浓度远大于荧光体的浓度,即Q0

10、µP0时在Q0µP0的情况下,如果K值大到足以使生物大分子与荧光探针小分子的相互作用有意义,而且荧光探针小分子的初始浓度P0相对较小,则可认为荧光体完全反应,此时荧光探针小分子趋向于被完全猝灭,则可假设:第3期张建荣等:生物大分子与有机小分子荧光探针相互作用的静态荧光猝灭理论及实验研究367Q0Q,Pn-Qnkn(13)将公式(7)(9)和(13)代入(2)得:K=nnPQPQ0(14)Q0由公式(14)得:F=nQ0nKnn-1即:F=F0kn-1(15)图1DNA低浓度时定量测定的工作曲线8.26×10-6mol/LMB,0.05mol/LTris2HCl缓将

11、公式(15)两边取对数可得:lg=lg+lgQ0n-1F0kFnn冲液(PH7.40);EXslitwidth:5nm,EMslitwidth:5nm,ex=650nm,em=677nm(16)Fig.1CalibrationcurveforlowofDNA公式(16)中,由于k、K,F0是定值,又由于Q0µP0,可认为n近似为常数,则lgF与lgQ0在一定的浓度范围内成线性关系.在实际应用中,况更有实际意义.淆F0/F,依据本文理论推导所得的,并可HSDNA定量测定的基础.而在相同的浓度范围,简单套用现有的小分子荧光猝灭理论所得关系式并混淆HSDNA初始浓度和平衡浓度所得的F0/F

12、Q0关系曲线则不存在线性关系.对HSDNA分别猝灭phen、RhB、CPFX、L2Trp荧光的实验研究结果均得到相同的结论.实验结果见表1.由此可以认为,在考虑生物大分子与小分子的作用位点数差异,严格区分生物大分子猝灭剂平衡浓度和初始浓度的基础上,在生物大分子猝灭剂初始浓度远小于小分子荧光探针浓度的条件下,所做的理论推导是正确的,所得关系式F=nkQ0更能反映实际2.2(HSDNA)分别猝灭亚甲基蓝(MB)7、邻菲啰啉(phen)、罗丹明B(RhB)、环丙沙星(CPFX)、L2色氨酸(L2Trp)等有机小分子荧光探针体系,在最佳实验条件下,验证了上述理论推导结果.(1)当猝灭剂的浓度远小于荧光

13、体的浓度,即Q0P0时图1为HSDNA摩尔浓度远小于MB的摩尔浓度条件下,HSDNA猝灭MB荧光的FQ0关系曲表1低浓度HSDNA猝灭不同荧光探针的实验结果Tab.1ExperimentresultsofdifferentfluorescenceprobesquenchedbylowconcentrationofHSDNA荧光探针CPFXMBPhenRhBL2Trp关系式FQ0F0/FQ0线性范围/mgmL-14.50×10-45.63×10-2拟合方程y=1.03×10-4x+48.0y=1.31×104x+11.1y=1.76×104x+1

14、8.6y=1.56×104x+23.3检测限/mgmL-13.81×10-42.61×10-41.94×10-42.19×10-49.47×10-4相关系数0.9940.9950.9970.9950.996无线性7.06×10-42.82×10-2FQ0F0/FQ0无线性4.70×10-43.53×10-2FQ0F0/FQ0无线性4.50×10-43.38×10-2FQ0F0/FQ0无线性5.28×10-30.16y=3.80×103x+2.8FQ0F0/

15、FQ0无线性368厦门大学学报(自然科学版)2006年Q0关系曲线.由图可知,即使是在生物大分子HSDNA摩尔浓度远大于MB的摩尔浓度条件下,简单套用小分子荧光猝灭理论所得的F0/FQ0关系也不呈线性,而依据本文理论推导所得的lg(1/F)lgQ0关系曲线则呈良好的线性关系.对HSDNA分别猝灭phen、RhB、CPFX、L2Trp荧光的实验研究结果均得到相同的结论.实验结果如表2所示.由此可以认为,在生物大分子猝灭剂初始浓度远大于小分子荧光探针浓度的条件下,所做的理论推导图2DNA高浓度时定量测定的工作曲线8.26×10-6是正确的,所得关系式lgnF=nlgmol/LMB,0.0

16、5mol/LTris2HCL缓n-1F0k+冲液(PH=7.40);Exslitwidth:5nm,Emslitwidth:5nm,ex=650nm,em=677nmFig.2CalibrationcurveforhighconcentrationofDNAlgQ0同样可以作为生物大分子猝灭剂初始浓度情况,因而更科学.由于实际体系通常是在生物大分子猝灭剂初始浓度远小于小分子荧光探针浓度的条件下,生物大分子的灵敏测定,测定方法的定量测定基础,.(2),即Q0µP0时图2为HSDNA摩尔浓度远大于MB的摩尔浓度条件下,HSDNA猝灭MB荧光的lg(1/F)lgQ0关系曲线和按照现有的小分

17、子荧光猝灭理论所得关系式并混淆HSDNA初始浓度和平衡浓度所得的F0/F,由此围.探针研究生物大分子体系并进行定量测定时,目前的相关研究普遍存在简单套用小分子间荧光猝灭理论的做法,这种做法忽视了生物大分子化合物具有多个作用位点的特性,并且在定量测定时混淆了猝灭剂初始浓度和平衡浓度的差异.本文的研究结果更能反映生物大分子静态荧光猝灭有机小分子荧光探针的实际情况,理论和实验结果均说明了这一点,因而是科学的.表2高浓度HSDNA猝灭不同荧光探针的实验结果Tab.2Experimentresultsofdifferentfluorescenceprobesquenchedbyhighconcentra

18、tionofHSDNA荧光探针CPFXMBPhenRhBL2Trp关系式lg(1/F)lgQ0F0/FQ0线性范围/mgmL-14.05×10-20.135拟合方程y=1.22x-0.99检测限/mgmL-13.97×10-42.73×10-42.07×10-42.17×10-49.82×10-4相关系数0.9920.9990.9920.9920.993无线性5.3×10-30.21y=0.44x-1.84lg(1/F)lgQ0F0/FQ0无线性y=0.88x-1.35lg(1/F)lgQ02.82×10-26.5

19、8×10-2F0/FQ0无线性2.7×10-48.1×10-2y=0.91x-1.29lg(1/F)lgQ0F0/FQ0无线性0.1320.3696y=1.04x-1.83lg(1/F)lgQ0F0/FQ0无线性第3期张建荣等:生物大分子与有机小分子荧光探针相互作用的静态荧光猝灭理论及实验研究369参考文献:1LacowiczJR.PreinciplesofFluorescenceSpectroscopyM.NewYork:PlenumPress,1983.2陈国珍,黄贤智,郑朱梓,等.荧光分析法M.2版.北5JiangCQ,WangT.Studyoftheint

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23、tofChemistryandofSciencesoftheMinistryofEducation,Collegeof,XiamenUniversity,Xiamen361005,China)Abstract:equilibriumconcentrationareusuallyconfusedintheapplicationofexistingtheoriesofflu2orescentstaticinthisarticle,thetheoryoffluorescentstaticquenchingbytheformationofcompoundoforganicmi2cromoleculewithmacrobiologicalmoleculewasstudied.TherelationshipconcerningtheapparentformationconstantKandthereac2tinglocusnumbernarededucedanddiscussed,andtheformulasofthequantitativedeterminationarealsodeducedandprovedbyex2periments.Thededucedresultasfol