海藻酸动态共价交联水凝胶的制备及其自愈合性能_张鸿鑫

1、第3期2016年3月高分子学报ACTA POLYMEICA SINICANo3Mar,2016368*2015-08-24收稿,2015-10-13修稿;广东省自然科学基金(基金号2014A030313379和国家自然科学基金(基金号81171459,31400824资助*通讯联系人,E-mail :tlulujnueducn ;tcrz9jnueducn doi :10.11777/jissn1000-3304.201615211海藻酸动态共价交联水凝胶的制备及其自愈合性能*张鸿鑫1鲁路1,2*李立华1,2焦延鹏1,2周长忍1,2*(1暨南大学材料科学与工程系2人工器官与材料教育部工程中心广

2、州510632摘要利用高碘酸钠氧化海藻酸得到带有醛基的海藻酸,利用水合肼与聚乙二醇反应得到末端为酰肼基的聚乙二醇,以二者为原料利用醛基与酰肼基反应形成酰腙键的动态化学反应,赋予天然生物大分子水凝胶优良的自愈性和pH 响应性通过红外光谱、核磁共振光谱、动态黏弹谱、电子万能试验机等表征了材料的结构、水凝胶的自愈合能力以及pH 响应性结果表明,该水凝胶具有良好的力学性能和自愈合能力,能够在不加热和不添加催化剂的情况下,在温和的生理环境下自发实现切口愈合同时水凝胶具有pH 响应性,在碱性环境中成凝胶,在酸性环境中则转变为溶液状态,并且这种凝胶溶液转变可重复多次这些优异的性能,加上简单的制备方法、良好的

3、生物相容性将为这类材料在生物医用领域的应用提供坚实的基础关键词海藻酸,水凝胶,自愈合,酰腙键海藻酸是从天然褐藻中提取的一种多糖,结构为直链型(14键合的-D-甘露糖醛酸(M 和-L-古洛糖醛酸(G 的无规嵌段共聚物,其中G 单元是M 单元在C-5位的立体异构体1海藻酸钠水溶液在遇到钙、铜、锌等二价金属阳离子(镁除外时,能够在温和的生理条件下迅速形成凝胶,因此被广泛应用于药物载体2、组织工程支架3、细胞微囊化免疫隔离技术4等生物医用5,6领域在多价离子与海藻酸形成的水凝胶中,以钙-海藻酸凝胶研究得最多作为细胞外基质,钙-海藻酸水凝胶能够为细胞生长提供三维生长环境,但由离子螯合形成的物理交联是可逆

4、的,组织液中大量的Na +、K +等离子能逐渐与高价离子发生置换,导致水凝胶力学强度降低7,较高的Ca 2+离子浓度也会影响细胞的生长,导致细胞毒性,触发细胞凋亡或细胞死亡8近年来研究者尝试利用多种形式的化学交联来制备具有多种功能的海藻酸水凝胶以满足其在生物医用领域的要求海藻酸钠与甲基丙烯酸酐反应可制备光交联海藻酸水凝胶,通过调节海藻酸中甲基丙烯酸酯的含量,能够控制凝胶的溶胀率、弹性模量和降解速率9Balakfishnan 等采用高碘酸钠使海藻酸钠部分氧化得到含醛基的海藻酸钠,利用Schiff碱反应,与含有大量氨基的明胶混合交联形成可原位成型的凝胶体系10Sun 等利用海藻酸和聚丙烯酰胺构建了

5、具有高拉伸和高韧性的双网络水凝胶11自愈合是活体组织的基本性能之一,生物组织受损之后会发生高效而复杂的自愈合过程,并可承受反复的伤害把生物学的概念引入高分子材料,形成具有自愈合功能的智能型材料称为自愈性材料12将自愈性这一特点引入生物医用水凝胶,具有重要的仿生意义,自愈性水凝胶能够更好的满足可注射水凝胶的要求,在注射过程中被破坏的结构可在生物体内重建另外,自愈性水凝胶作为三维细胞培养载体有着独特的优势,能够更好地模拟细胞生存环境,有助于细胞间的接触信息传递,实现多种、多层细胞的共培养等酰腙键13,14是当前动态化学领域备受关注的一种可逆共价化学键,通过它制备的凝胶不但具有良好的稳定性,而且由于

6、酰腙键在酸催化下的反应是一个可逆反应15,16,因此有望制备同时具有pH 响应特性及自愈性的水凝胶本研究利用生物相容性优良的生物大分子海藻酸和聚乙二醇(PEG 作为主要原料,使用高碘酸钠氧化海藻酸制备了含有醛基的氧化海藻酸(ADA ,并通过水合肼与3期张鸿鑫等:海藻酸动态共价交联水凝胶的制备及其自愈合性能聚乙二醇反应,得到末端为酰肼基的聚乙二醇(PEG-DF,进一步利用醛基与酰肼基反应形成酰腙键,赋予海藻酸水凝胶自愈性和pH响应性,为该类材料在生物医用领域的应用奠定了基础1实验部分1.1主要原料海藻酸钠,食品级,青岛晶岩生物科技开发有限公司(粒度为60目,黏度为530MPa·s;PE

7、G 2000,天津市大茂试剂厂;其他试剂如未做特殊说明,均为分析纯,购自广州化学试剂厂1.2部分氧化海藻酸的制备与表征强氧化剂高碘酸钠可以氧化邻二醇结构,使其成为醛或酮,海藻酸钠与高碘酸的反应式如示意图1所示将5g海藻酸钠均匀分散于25mL 无水乙醇中,将2.7g高碘酸钠溶于25mL去离子水中制成溶液并加入到海藻酸钠分散液中,避光条件下磁力搅拌6h,加入与高碘酸钠等物质的量的乙二醇终止反应,继续搅拌1h反应产物在去离子水中透析(透析袋截留分子量8000 14000,每4h换水,直至去离子水的电导率不再发生变化,40下冷冻干燥得到ADA样品 Scheme1Oxidation of alginat

8、e取制备的ADA少量,KBr压片法制样,使用德国Bruker公司EQUINOX55型傅立叶变换红外光谱仪对产物进行红外光谱分析利用盐酸羟胺-电位滴定法测定醛基含量17,具体方法如下:利用盐酸羟胺与醛基反应生成肟,同时释放HCl,配制一定浓度的NaOH溶液,对释放出的HCl进行滴定实际氧化度(OD定义为被氧化的糖醛酸单元占海藻酸中所含糖醛酸单元的比例,如式(1所示OD=nCHO/2nhexuronic acids100%(1其中n CHO为盐酸羟胺-电位滴定法测定的醛基的物质的量,n hexuronic acids为试样中所含的糖醛酸单元的物质的量1.3末端为酰肼基的聚乙二醇的合成与表征PEG-

9、DF的合成反应如示意图2所示,参考文献18的方法,具体操作步骤如下:首先将5.24g PEG2000溶解在90mL无水甲苯中,加入17mL溶解了1.8g叔丁醇钾的叔丁醇溶液,充分混合后,通入氮气20min然后,将3.2mL溴代乙酸乙酯逐滴滴加到溶液中,室温下搅拌24h,过滤除去副产物,将滤液旋蒸浓缩,在冰乙醚中沉淀,得到白色沉淀的中间产物第二步,将5g中间产物溶于100mL甲醇中,然后缓慢加入水合肼的甲醇溶液(30mL水合肼溶于40mL甲醇中室温下搅拌24h,旋蒸浓缩,将浓缩液用二氯甲烷萃取,萃取液用无水硫酸镁干燥过夜过滤浓缩后,在冰乙醚中沉淀,得到PEG-DF产物 Scheme2Synthe

10、sis of PEG-DF将PEG-DF溶于氘代二甲基亚砜,置于核磁管中,使用德国Bruker公司ascend TM500型核磁共振光谱仪对PEG-DF结构进行分析表征1.4水凝胶的制备与表征将ADA与PEG-DF分别溶于PBS缓冲液(pH=7.4中形成均相溶液,将两种溶液直接漩963高分子学报2016年涡混合均匀(如未特别注明,体系中醛基和酰肼基摩尔比52,室温下即可形成均匀透明的水凝胶水凝胶的自愈合性表征采用模具制备2组圆柱形水凝胶(直径(101mm ,高(81mm ,其中一组添加少量罗丹明B (20L ,5mg /mL 染色将3个圆柱形水凝胶首尾相接,在接界处滴加20L PBS 用于润湿

11、表面,将拼接好的凝胶室温下放置12h 后,观察水凝胶自愈情况同时用原位释放的方法19制备钙离子交联的海藻酸水凝胶作为对照组水凝胶的动态黏弹性测试使用Kinexus pro旋转流变仪(Malvern Instruments ,UK ,所用夹具为平板,直径40mm ,试验温度25,夹具边缘用 硅油密封以防止水分挥发利用动态黏弹谱跟踪体系的自愈合过程步骤如下:将两组份混合均匀后置于平板夹具上,利用时间扫描跟踪凝胶化过程,当体系的模量不再变化,说明交联完全并形成稳定的三维网络结构;然后打开夹具将水凝胶切成16等份,并滴加20L PBS (pH =6润湿切面,重新合上夹具,一定时间后对样品进行动态频率扫

12、描压缩和拉伸试验使用SHIMADZU AG-I 型高精度电子万能试验机进行压缩试验试样为圆柱形,直径(101mm ,高(81mm ,压缩速率1.0mm /min使用手术刀片将圆柱型水凝胶纵切成4等份,在切口处滴加20L PBS (pH =6润湿切面,一定时间后进行同条件压缩测试拉伸试验采用哑铃型样条,标距15mm ,横截面2mm 4mm拉伸速率1.0mm /min使用手术刀片将哑铃型水凝胶从标距中心位置切开,在切口处滴加20L PBS (pH =6润湿切面,一定时间后进行同条件拉伸测试 2结果与讨论2.1氧化海藻酸的表征海藻酸钠的糖醛酸结构单元中具有顺式邻二醇结构,因而能与高碘酸钠反应,发生C

13、 C 键断裂,生成2个醛基这个反应是定量进行的,每断1mol 碳-碳键消耗1mol 高碘酸钠,因此可以通过控制高碘酸钠的量来控制海藻酸钠的氧化度氧化前后海藻酸钠样品的红外光谱图如图1所示,氧化海藻酸在1731cm 1处出现了1个新的特征峰,该峰应归属于醛基的 C O 振动吸收峰,醛基的另一特征峰v (CO H 在2855cm 1出现因此可以证明通过高碘酸钠氧化我们得到了醛基化的海藻酸钠利用盐酸羟胺-电位滴定法测定的醛基含量为4.91mmol /g ,计算得到海藻酸钠的实际氧化度为48.6%海藻酸被氧化后顺二醇结构转化为醛基,糖环打开,此时原糖醛酸上的C (1结构成为同碳二元醚,可将其看作类似缩

14、醛的结构,而缩醛结构容易发生水解,因此部分氧化海藻酸钠可按照类似缩醛的水解机理降解20氧化海藻酸不仅引入了醛基,也解决了海藻酸在体内难以降解的问题2.2末端为酰肼基的聚乙二醇的表征PEG-DF 的1H-NM谱图以及各个峰的归属如图2所示,在=8.89处,出现1个CO NH 小而尖的单峰,在=4.50 4.64处,出现1个NH 2的小而宽的峰,根据d 、b 、c 3处的积分面积,计算得到PEFG-DF 的酰肼基封端率为96.6%(S c S b SFig1Ispectra of sodium alginate with and withoutoxidizationFig21H-NMspectru

15、m of PEG-DF in DMSO-d 6733期张鸿鑫等:海藻酸动态共价交联水凝胶的制备及其自愈合性能2.3水凝胶的形成水凝胶的形成过程是酰肼和醛基发生反应形成酰腙交联点并逐渐形成网络结构的过程,凝胶结构形成示意图如图3所示ADA上的醛基与PEG-DF上的酰肼基能够形成酰腙键,酰腙键在动态共价化学交联中属于结合较稳定的一类,可以在中性或者碱性的水溶液中稳定存在,在酸性溶液或者在高温催化下,酰腙键的水解和转胺速率会得到显著的提高21利用动态黏弹谱跟踪了体系的凝胶化过程 ,Fig3Schematic illustration of the self-healing hydrogel base

16、d on reversible covalent acylhydrazone bond结果如图4所示在2组份混合初始阶段,体系的损耗模量大于储存模量,呈现出黏弹性液体的行为随着时间延长,弹性的贡献逐渐超过黏性的贡献,体系发生了凝胶化,形成了贯穿整个体系的三维交联网络结构随着体系中固含量的增加,体系的凝胶化时间缩短,当体系中固含量为18%时(ADA6wt%,PEG-DF12wt%,凝胶化在1min内完成,而当体系中固含量为9%时(ADA3wt%,PEG-DF6wt%,凝胶化则需要20min以上因此可以通过控制体系中ADA和PEG-DF的浓度来调控凝胶化时间不同固含量水凝胶的动态频率扫描结果如图5

17、所示,随着体系中固含量增加,体系的交联网络密度增加,储能模量逐渐增大样品在较宽的频率范围内,储能模量不依赖于频率变化,证明体系形成了稳定的凝胶网络结构当固含量达到12%(ADA4wt%,PEG- DFFig4Time dependence of storage modulus G'(solidandloss modulus G!(hollowfor the hydrogel samples during thegelation process with indicated solid content at25(frequency1.0Hz;strain1.0%8wt%以上时,提高体系浓

18、度对水凝胶模量提高173高分子学报2016年的影响逐渐减弱 Fig5Angular frequency dependence of storage modulus G '(solid and loss modulus G !(hollow for the hydrogel samples with indicated solid content at 25(strain 1.0%2.4水凝胶的自愈性酰腙键在酸催化下的反应是一个可逆的反应,因此在形成的凝胶中必然存在着动态的交换性,酰腙键的动态平衡性具有可逆交换速度快、可逆反应条件温和、可逆反应可控的特点,基于这些性质我们考察了水凝胶的自

19、愈合能力图6显示了水凝胶的自愈合情况,将不同颜色的水凝胶拼接、放置12h 后,对ADA 与PEG-DF 形成的水凝胶(图6(a 6(c 施加弯曲、拉伸等应力,凝胶接界处未产生断裂情况,说明水凝胶实现了自愈合,且能够承受一定的外力;而相同条件下海藻酸钠与Ca 2+形成的水凝胶(图6(d 6(f 无法实现自愈合进一步利用动态黏弹谱跟踪了体系的自愈合过程,为了检测凝胶切口是否愈合,我们采用了较大的应变值Strain =20%测定体系的储存模量,为了避免大应变对自愈合过程和动态模量测试带来的影响,对样品进行了一定时间点的频率扫描,结果如图7所示,随着愈合时间的延长,储存模量逐渐增大,2h 后水凝胶的储

20、存模量恢复到原始模量的90%以上 Fig6Digital photographs show the self-healing properties of hydrogels :(a c ADA and PEG-DF hydrogel and (d f Ca 2+crosslinked alginatehydrogel Fig7heological characterization of the self-healing process at 25(12wt%solid content ,strain 20%2733期 张鸿鑫等： 海藻酸动态共价交联水凝胶的制备及其自愈合性能 373 体系愈合过

21、程中， 宏观力学性能也随之发生 改变， 利用电子万能试验机测定了水凝胶在愈合 过程中的压缩和拉伸曲线， 结果如图 8 所示 图 8 （ a） 是压缩应力应变曲线， 接触愈合 4 h 后， 水凝 胶已部分愈合， 最大压缩应变达 60% ， 最大压缩 应力约 50 kPa， 随着接触愈合时间的延长， 凝胶逐 渐恢复， 当愈合时间达到 24 h 时， 水凝胶的压缩 力学性能基本恢复到原始水平 图 8 （ b） 是拉伸应 力应变曲线， 随着愈合时间的延长， 拉伸应力和 24 h 拉断应力恢复到原始 拉断伸长率逐渐恢复， 水平的 90% 接触面的湿润的环境为水凝胶的愈 合面提供了空间， 保证了断面的充分

22、接触， 另外弱 酸性环境为酰腙键的打开 / 结合提供了有利条件， 使得凝胶快速愈合恢复成为可能 Fig 8 Stressstrain curves for the hydrogel during the selfhealing process （ a） Compressive stressstrain curves for samples with 12% solid content （ b） Tensile stressstrain curves for samples with 18% solid content 2. 5 凝胶的 pH 响应性 酰腙键的形成和断裂在室温下的酸催化过程 是可

23、逆的， 因此可以通过调控环境的 pH 值来实 现体系的凝胶和溶液转变 如图 9 所示， 在氧化海 20 L ， 藻酸水凝胶中加入 冰醋酸 漩涡震荡， 此时 体系 pH 约为 3. 5 ， 凝胶逐渐转变为溶液； 当凝胶 完全变成溶液后， 向其中再加入 25 L 三乙胺， 体 系 pH 约为 7 ， 放置 5 10 min， 体系再次形成稳定 凝胶 这种 pH 诱导的凝胶溶液转变是可逆的， 可 多次反复进行 但是伴随着凝胶溶液转变次数的 增加， 醋酸和三乙胺的加入量增加， 体系中高分子 浓度降低， 离子强度增大， 最终不再对加入的酸碱 做出响应 体系能够实现的凝胶溶液转变次数与 DF 的浓度相关，

24、 氧化海藻酸和 PEG当体系中固 含量为 6% 时， 能够实现 2 次凝胶溶液转变， 当 体系中固含量达到 18% 时， 可实现 9 次凝胶溶液 转变 Fig 9 Storage modulus of the samples under repeated process by adjusting pH （ original hydrogels with 12 wt% solid content ） 溶胶转变可逆性， 而且可以在不 物理凝胶的凝胶加热和催化剂的情况下， 在温和的生理条件下自 发实现切口愈合， 是一种真正意义上的自愈合材 料 该水凝胶以具有良好生物相容性的海藻酸和 PEG 为主要原

25、料， 有望作为可注射的组织工程支 架材料和药物控释材料， 另外良好的自愈性能为 该类材料在多层细胞的三维培养方面奠定了良好 的基础， 为研究细胞与材料， 细胞与细胞间的相互 作用以及功能化的组织工程支架的构建提供了良 好的载体 3 结论 本研究通过高碘酸钠氧化海藻酸得到带有醛 基的海藻酸， 通过水合肼与聚乙二醇反应得到末 端为酰肼基的聚乙二醇， 以二者为原料， 利用酰腙 键动态平衡的特性， 赋予天然大分子水凝胶优良 的自愈性能以及 pH 响应性 该水凝胶不仅具有 374 高 分 子 学 报 2016 年 EFEENCES 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

26、16 17 18 19 20 21 Boontheekul T， Kong H J， Mooney D J Biomaterials， 2005 ， 26 ： 2455 2465 Martin M J， Calpena A C， Fernandez F Carbohyd Polym， 2015 ， 117 ： 140 149 Drury J L， Mooney D J Biomaterials， 2003 ， 24 ： 4337 4351 Chayosumrit M， Tuch B， Sidhu K Biomaterials， 2010 ， 31 ： 505 514 Benson K， Gal

27、la H J， Kehr N S Macromol Biosci， 2014 ， 14 ： 793 798 Peppas N A， Bures P， Leobandung W Eur J Pharm Biopharm， 2000 ， 50 ： 27 46 Moshaverinia A， Chen C D， Akiyama K J Biomed Mater es A ， 2013 ， 101 ： 3285 3294 Orrenius S， Zhivotovsky B， Nicotera P Nat ev Mol Cell Bio， 2003 ， 4 ： 552 565 Jeon O， Bouha

28、dir K H， Mansour J M Biomaterials， 2009 ， 30 ： 2724 2734 Balakrishnan B， Jayakrishnan A Biomaterials， 2005 ， 26 ： 3941 3951 Sun J Y， Zhao X H， Illeperuma W K Nature， 2012 ， 489 ： 133 136 Wu D Y， Meure S， Solomon D Prog Polym Sci， 2008 ， 33 ： 479 522 Lehn J M Prog Polym Sci， 2005 ， 30 ： 814 831 Lehn

29、J M Chem Soc ev， 2007 ， 36 ： 151 160 Han X J， Dong Z Q， Fan M M Macromol apid Comm， 2012 ， 33 ： 1055 1060 Ding F Y， Wu S P， Wang S S Soft Matter， 2015 ， 11 ： 3971 3976 Zhao H， Heindel N D Pharm esDordr， 1991 ， 8 ： 400 402 Xue J， Jia Z F， Jiang X L Macromolecules， 2006 ， 39 ： 8905 8907 Qu B， Chen C S

30、， Qian L Y Mater Lett， 2014 ， 137 ： 106 109 Bouhadir K H， Lee K Y， Mooney D J Biotechnol Progr， 2001 ， 17 ： 945 950 Liu F Y， Li F Y， Deng G H Macromolecules， 2012 ， 45 ： 1636 1645 Alginatebased Selfhealing and pHresponsive Hydrogels Formed by Dynamic Covalent Bonding Hongxin Zhang1 ，Lu Lu1，2* ，Lihua

31、 Li1，2 ，Yanpeng Jiao1，2 ，Changren Zhou1，2* （ 2 1 Department of Materials Science and Engineering ，Jinan University， Engineering esearch Center of Artificial Organs and Materials，Ministry of Education，Guangzhou 510632 ） Abstract A selfhealable hydrogel was prepared by selfcrosslinking two biocompatib

32、le materials oxidized alginate containing dialdehyde groups and PEG with acylhydrazine groups Oxidation reactions on OH groups at C2 and C3 positions of the uronic units of sodium alginate were performed with sodium periodate PEG with acylhydrazine terminals was synthesized by PEG and hydrazine hydrate The generation of the selfcrosslinked hydrogel relies on the dynamic covalent linkage through a