暗紫贝母的组织培养和植株再生

1、暗紫贝母的组织培养和植株再生马吉义 （青海师范大学 生地学院 青海 西宁 810008）摘要: 本研究以暗紫贝母鳞茎为材料，进行了暗紫贝母不定芽的诱导、增殖，以及苗的生根培养、移栽的研究，并建立快速无性繁殖系。诱导鳞茎不定芽的最佳培养基是MS+NAA 2.0mg/L +6-BA 0.5mg/L；最佳增殖培养基是MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L中；生根的最佳培养基是1/2MS+NAA 0.1mg/L；本实验建立了完整的暗紫贝母植株再生体系，移栽成活率高。关键词：暗紫贝母，组织培养，愈伤组织暗紫贝母(Fritillaria uni-bracteata Hsiao et K.

2、C. Hsia.) 为著名的川产地道药材，是松贝的主要来源，为川贝类商品药材的主流品种之一，以地下鳞茎入药。用于肺热燥咳、干咳少痰、阴虚劳嗽、咯痰带血。暗紫贝母野生于海拔32004500米，阳光充足、腐殖质丰富、土壤疏松之草原上。分布于四川西部、青海南部及甘肃南部等地区。由于暗紫贝母对气候、温度、土质等生长环境条件要求特殊，人工栽培很困难，商品药材全靠采挖野生资源，由于连年过度采挖，资源日趋减少并面临枯竭。国内外有关贝母组织培养鳞茎方面的研究很多【2-7】。但有关暗紫贝母鳞茎为外植体而得到再生植株的报道比较少。本论文以暗紫贝母的鳞片为外植体，探讨研究了不同调节因子组合对其不定芽诱导、增殖、生根

3、及其移栽情况，以期为暗紫贝母工业化生产提供可靠的理论依据。1材料与方法1.1 供试材料供试材料为生长23年的暗紫贝母（）鳞茎。1.2 培养条件以MS为基本培养基，初代培养基和增殖培养基附加蔗糖30g/L，琼脂6.5%，PH值为5.8，不同浓度NAA、6-BA。生根培养基为1/2MS培养基附加不同浓度的NAA。所有培养基均在121条件下高压灭菌20min。1.3 无菌体系的建立与不定芽诱导取无病虫害的暗紫贝母鳞茎，去掉最外面一层腐烂、褐化的鳞片，再将根系切除。先用纱布轻轻擦拭鳞茎表面，然后将鳞瓣剥下，放入洗衣粉溶液中浸泡10一15min，自来水下冲洗2h，置于超净工作台上进行表面灭菌。使用五种灭

4、菌方式对外植体进行灭菌处理，最后用无菌水冲洗56次，灭菌好的材料均接种于附加不同浓度6一BA与NAA组合的MS培养基中进行培养，筛选出适合的灭菌方式。接种10d后统计污染率，45d后统计不定芽诱导率。1.4不定芽的增殖培养进行不定芽增殖研究时，选用从鳞片诱导出的不定芽作为材料，将老化的和生长不良的不定芽去掉，并将生长状态良好的不定芽切成单芽，再转移至新的固体培养基上，并附加NAA、6-BA的不同浓度组合，每瓶接4-5不定芽，培养周期为30d，统计不定芽的长势。通过统计和对比不定芽个数以及生长状况，研究不同浓度NAA、6-BA组合对不定芽增殖的影响，培养30d后统计不定芽的个数，筛选出最适合鳞片

5、不定芽增殖的激素组合。1.5无菌苗的生根及结鳞茎试验将生长较一致且健壮的未生根的无菌苗单株切下转入生根培养基诱导，基本培养基为l/2MS，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5，每组接种10瓶，每瓶3株芽苗。1.6驯化与移栽将生根的无菌苗从培养室中取出放在室外炼苗30天后，再将生根苗从瓶中取出洗去基部的培养基，然后移栽到经过高温灭菌的营养土中，定期浇浇营养液，覆盖薄膜，lO天后揭膜，揭膜后20天统计成活率。2 结果与讨论2.1 不同灭菌方法对鳞茎灭菌的效果暗紫贝母的鳞茎带菌严重，通常的灭菌方法往往难以取得满意的效果。因此，我们采用了五种不同的灭菌方法（见表3-1）对暗紫贝母鳞茎进行了灭菌，3周后通过比

6、较染菌率及存活状态得到了适用于暗紫贝母鳞茎的灭菌方法。表3-1 不同灭菌方法对暗紫贝母鳞茎灭菌效果的影响Table 3-1 Effect of different sterilize method of surface in culture 编号灭菌方法染菌率存活状态175%乙醇浸泡30s，0.05%升汞浸泡10min，无菌水清洗5次25%生长不旺盛275%乙醇浸泡2min，0.04%升汞浸泡30min，无菌水清洗5次47.5%生长不旺盛375%乙醇浸泡15s ，10%次氯酸钠浸泡20min，无菌水清洗5次7.5%生长旺盛475%乙醇浸泡5min，0.1%升汞浸泡15min，无菌水清洗5次10

7、%生长较旺盛575%乙醇浸泡5min，15%新洁尔灭浸泡10min，0.1%升汞浸泡15min，无菌水清洗5次27.5%生长不旺盛*染菌率=（染菌外植体数/接种外植体总数）*100% 从表3-1可以看出方法3和方法4的灭菌效果比较好，但相比较而言，在染菌率和外植体存活状态明显表现出方法3更适合于暗紫贝母鳞茎器官的表面灭菌。2.2不同浓度6一BA与NAA组合对不定芽诱导暗紫贝母鳞片基部接种在不同浓度6-BA与NAA的诱导培养基上，培养15d后逐渐从外植体分化出不定芽，40d后统计分化率。由表3-4可知，随着NAA浓度提高，鳞片的分化率也随之提高，当NAA浓度由0.5mg/L至2.0mg/L时，其

8、出芽率随之提高，但当NAA浓度由2.0mg/L达到 3.0mg/L时，出芽率升高但分化出的丛芽太过密集，单芽质量差，有的还出现畸形、玻璃化等现象；而6-BA浓度增加到1mg/L时，分化率有所降低，鳞片上分化出的芽出现畸形，而且分化出很粗长的根，说明高浓度的细胞分裂素不利于不定芽的分化。在本试验中适合鳞片分化的优化组合为MS+NAA 2.0mg/L +6-BA 0.5mg/L，此培养基上的鳞片的出芽率较高，分化出的不定芽叶色浓绿、叶片展开，芽健壮。表3-4不同浓度6-BA与NAA组合对不定芽诱导影响Table 3-4 Effeet of different coneentration of 6-

9、BA、NAA on differentiation sprout of scaleNAA（mg/L）6-BA（mg/L）接种数（块）出芽块数（个）出芽率(%)0.5040717.50.50.54014350.51.04012301.00401947.51.00.54022551.01.040922.52.0040372.00.5402972.52.01.0402152.53.00.54010252.3不定芽的继代增殖培养将分化出的不定芽切成单芽接种MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L中(表3-8)，培养10d后发现，在芽基部逐渐长出新的不定芽，这些不定芽长到约2-3cm时便可

10、以再继代增殖，30d左右继代一次。在试验的激素组合中，以NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L组合作为继代增殖培养基效果最好，发现芽苗生长健壮，叶片展开、叶色浓绿、有利于下一步的生根培养。表3-8不同细胞分裂素NAA浓度对不定芽继代增殖培养的影响Table 3-8Effeet of different coneentration of CTK on multiplication and differentiationNAA（mg/L）6-BA（mg/L）转接芽数（个）每芽平均增值数芽生长状况0.10.5300.13+0.20.5281.25+0.30.5331.34+0.40.529

11、1.17+0.50.5323.17+0.60.5251.05+注：“+”表示越多生长越好2.4 生根及壮苗培养、移栽将以分化再生暗紫贝母植株转入到生根培养基中，在1/2MS+NAA0.1mg/L中，培养10天后，不仅有健壮的根长出，而且可成为完整的再生植株。待进行生根培养的增殖苗当高达3-5cm，特别是根长达1-1.5cm时可进行移栽。移栽前一周左右的时间将生根较好的增殖苗的三角瓶打开，室温、散射光下进行炼苗2-3天。炼苗完成后，即可对其进行移栽，将无菌苗从瓶中取出，洗净根部附着的培养基，尽量不要弄伤根部，然后假植在上面的营养土上。种完后，浇透水，最初几天要盖上塑料薄膜，使沙床内保持90100%的湿度。7d后，逐渐揭去薄膜，让苗逐渐适应外界的环境，要逐步增加光照，使小苗慢慢适应，观察发现，假植7-10d后，开始有新根长出，30d后统计成活率发现，只要长了小鳞茎的无菌苗移栽成活率高达90%。参考文献1 姜荣兰等四川中草药研究1993；(33 34)：182 李隆云, 周裕书, 代敏等。暗紫贝母鳞茎再生组织培养技术研【J】究中国中药杂志, 1995,20（2）：783 高山林,朱丹妮,等.暗紫贝母鳞茎器官培养生长特征和生物碱积累的研究J.中国药科大学学报，1992，23（3）：144-1474 陈敏, 陈和荣, 钟凤林等.川贝母组织培养的研究