杭州西湖水体中异养细菌生长的限制因子

1、杭州西湖水体中异养细菌生长的限制因子3吴根福133杨志坚1周雪平1吴洁2(1浙江大学,杭州310028;2杭州市环境保护监测站,杭州310007【摘要】通过添加不同营养盐类的纯种和自然培养试验,对异养细菌生长的限制因子进行了研究.结果表明,生物可利用的有机碳是主要的限制性营养因子,而氮源和磷源的影响相对较小;湖水的高p H 、丰富的藻类和浮游动物生物量也制约了异养细菌的生长.此外还发现,在自然水体中添加0.5%葡萄糖后,一些自生固氮细菌得到富集;添加C +N +P 后,有大量霉菌生长,添加0.01%牛肉膏后,假单胞菌属(Pseu 2domonas 细菌由原来的30%提高到57%;湖水进行实验室

2、培养时细菌的最大生长量可达105个ml -1.关键词杭州西湖水体异养细菌限制因子文章编号1001-9332(200308-1343-04中图分类号Q938.8文献标识码AF actors restricting grow th of heterotrophic b acteria in the w ater body of West Lake ,H angzhou.WUG enfu 1,Y AN G Zhijian 1,ZHOU Xueping 1,WU Jie 2(1Zhejiang U niversity ,Hangz hou 310028,China ;2Hangz hou M anic

3、ipal Environmental Monitoring Center ,Hangz hou 310007,China .2Chin.J.A ppl.Ecol .,2003,14(8:13431346.Restricting factors of bacteria growth were studied by pure culture and natural culture test.The results showed that organic carbon source available for bacteria was more important than (NH 42SO 4an

4、d KH 2PO 4,while high 2er p H ,and rich biomass of phytoplanktons and zooplanktons in the water restrained the growth of heterotrophic bacteria.Under natural culture experiment ,A zotobacter increased after 0.5%glucose was added ,and a lot of mildew grew after adding 0.5%glucose with 0.1%(NH 42SO 4a

5、nd 0.1%KH 2PO 4,while Pseudomonas en 2riched 3057%after adding 0.01%beef extract.It was also showed that bacteria growth potentiality in natu 2ral water could reach to 105cfu ml -1.K ey w ords Hangzhou ,West Lake ,Water body ,Heterotrophic bacteria ,Restricting factors.3浙江省自然科学基金(9515106及中日合作基金资助项目.

6、33通讯联系人.2001-06-20收稿,2001-10-08接受.1引言杭州西湖是我国著名的风景旅游湖泊,由于生产的发展和人们生活水平的提高,逐渐富营养化.湖水的COD Mn 平均达7.61mg L -1,BOD 5达5.72mg L-1.总N 、总P 分别为2.204和0.125mg L-1,平均透明度仅为46cm12.但是从水体中生长的异养细菌来考察,19881989年全湖平均为1296个ml -1,19951996年全湖平均为1180个ml -114,19992000年全湖平均为1632个ml -1,按照湖泊分类标准,应属中营养型.为了探讨杭州西湖水体中微生物生长的限制因素,本文在分析

7、现场调查数据的基础上,对实验室条件下水体中微生物生长的主要限制因子进行了分析,以期为杭州西湖的综合治理提供参考.2材料与方法211西湖的自然概况杭州西湖位于杭州市的西部,是一个浅水湖泊,平均水深仅1.56m ,湖水不发生分层现象.西湖地处亚热带季风气候区,温暖湿润,促成浮游动物和藻类的大量繁殖3.212试验方法21211纯种培养试验参照文献7的方法,取西湖水,用普通滤纸过滤,以去除悬浮颗粒,减少浮游动物及藻类残体的影响,装入250ml 三角瓶,每瓶50ml ,加入不同浓度的葡萄糖、(NH 42SO 4、KH 2PO 4、0.01%牛肉膏和1%复合维生素贮存液(硫胺素20mg ,吡哆醇20mg

8、,烟酸20mg ,泛酸20mg ,生物素0.2mg ,肌醇1mg ,蒸馏水1000ml 后,0.1MPa 灭菌30min ,冷却后接入大肠杆菌(Escherichia coli 或金黄色葡萄球菌(S taphylococcus aureus ,34培养,每隔12h 计数.21212自然培养试验同上法,将50ml 滤过之西湖水装入已灭菌的250ml 三角瓶中,加入不同浓度的C 、N 、P 、牛肉膏(经灭菌处理后,34培养,每隔12h 计数(尽可能无菌操作.21213p H 影响试验将过滤的湖水(p H8.8用2mol L -1HCl 调p H 至7.7、7.1、6.3和5.5,34培养48h 后

9、,测定异养细菌数量,调节肉膏蛋白胨培养基的p H 至7.0、8.0、9.0和10.0,观察西湖水体中细菌的耐碱性.应用生态学报2003年8月第14卷第8期CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Aug.2003,14(81343134621214藻类影响试验将滤过的西湖水在光照(2200lx和黑暗条件下培养(25,每隔12h摇动一次,48h后测定细菌的生长量.21215浮游动物影响试验用25号筛绢网富集浮游动物,按一定比例加至50ml过滤的西湖水中,使其中的浮游动物接近自然状态(约5500indL-1,34培养48h后测定细菌的生长量.21216微生物生长

10、量测定用牛肉膏蛋白胨培养基,常规稀释涂平板法,34培养2d后计数;或测定培养液的光密度(OD560来推知生长量.21217其他指标测定总N、总P用过硫酸盐氧化法,叶绿素a用分光光度法4,浮游动物按李共国方法6测定,细菌的鉴定参照文献2,5.3结果与讨论311异养细菌数量及其与TN、TP的关系19992000年杭州西湖5个子湖区水体中异养细菌数量与总N,总P含量的测定结果(表1表明,总N和总P均达到或超过富营养化标准,而异养细菌数量却与中低营养湖泊相近.表1异养细菌数量与总N、总P含量T able1Population of heterotrophic b acteria and content

11、 of TNand TP项目Item北里湖Beili Lake岳湖Yue Lake西里湖Xili Lake外湖Outer Lake小南湖Xiaonan Lake评价Evaluation异养细菌Heterot21482238621151260916中营养Mid2trophic rophic bacteria(cfuL-1总N Total 2.04 2.88 2.26 1.98 1.86富营养Eutrophic nitrogen(mgL-1总P Total0.1560.1600.1220.1250.098富营养Eutrophic phosphorus(mgml-1通过分析可知,异养细菌与总N的相关

12、性较大,相关系数达0.9060,与总P的相关性相对较小,相关系数为0.7111,所以P可能不是异养细菌生长的限制因子.312N、P对异养细菌生长的影响纯种培养试验表明(表2,添加P后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌增加明显不及添加N后的增加量,说明西湖水体中N比P更限制了微生物的生表2N、P对异养细菌生长的影响T able2E ffect of N and P on the grow th of heterotrophic b acteria组别Group 添加磷浓度Phosphorusconcentration(mgL-10.0750.750添加氮浓度Nitrogenconcentration(mg

13、L-12.2522.5细菌生长量CFU of heterotrophicbacteria(105cfuL-1葡萄球菌S.aureus大肠杆菌E.coli1- 2.85±0.61 2.36±0.42 2+- 3.22±0.38 2.28±0.55 3-+- 4.02±0.56 2.85±0.36 4-+- 3.95±0.52 3.29±0.62 5-+9.44±1.05 5.24±0.72 6+-+- 4.06±0.64 3.75±0.48 7-+-+9.35±0.5

14、0 6.02±0.84长.看来在西湖周围的截污工作初建成效后,底泥中大量的P释放引起了湖泊P浓度的偏高14.313碳源对异养细菌生长的影响纯种培养试验的结果表明,添加0.05%葡萄糖和0.5%葡萄糖后,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长量均有较显著增加(图1,说明就西湖水体而言,细菌可利用的碳源比N、P源更缺乏.虽然水体中发现有较多的悬浮颗粒,而且含碳量也较高, COD Mn平均达7.61mgL-1,但大部分以活体藻类及原生动物的形式存在,不能被细菌直接利用,或以 大分子非溶解性碳素形式存在,只有在细菌分泌的胞外酶作用后才能被利用13.由于西湖中游船很多,风浪较大,再加上引水工程建立后,

15、有大量钱塘江水引入,使西湖的换水率较高,这样就影响了水体中局部范围内水解酶的浓度,而且西湖平均水深只有1.56m,泥水之间的交换比较频繁,底泥中酶的浓度也较低16,因此对大分子碳素的分解能力较弱,致使细菌可利用的有机碳含量偏低,生长量较少.从图1可看出,添加0.5%的葡萄糖后细菌生长量与添加0.05%时相差不多,说明湖水中各种营养基本平衡,限制性物质的浓度并不是特别的低.图1添加葡萄糖对湖水纯种培养的影响Fig.1Effect of glucose on growth of E.coli and S.aureus.0.05%葡萄糖,大肠杆菌0.05%Gulcose,E.coli,.0.05%葡

16、萄糖,金黄色葡萄球菌0.05%G lucose,S.aureus,.0.5%葡萄糖,大肠杆菌0.05%Gulcose,E.coli,.0.05%葡萄糖,金黄色葡萄球菌0.05%G lucose,S.aureus.314牛肉浸膏及生长因子对异养细菌生长的影响图2反映了纯种培养过程中牛肉浸膏及生长因子对异养细菌生长的影响.添加1%的复合维生素贮备液后细菌生长量并没有显著增加,所以维生素可能不是细菌生长的限制因子.添加0.1%牛肉膏后细菌数量增加较多,这与牛肉膏中所含的营养成分十分全面有关.315细菌的耐碱性试验及p H对细菌生长的影响西湖水体中细菌的耐碱性见表3.从表3可见,4431应用生态学报1

17、4卷图2添加牛肉膏及维生素对湖水纯种培养的影响Fig.2Effect of beef extract and mixed vitamin on growth of E.coli and S.aureus.0.1%牛肉膏,大肠杆菌0.1%Bf,E.coli,.0.1%牛肉膏,金黄色葡萄球菌0.1%Bf,S.aureus,.1%复合维生素,大肠杆菌1% Vt,E.coli,.1%复合维生素,金黄色葡萄球菌1%Bf,S.aureus.西湖水体中的异养细菌都耐弱碱性,p H7.0的培养基中生长的细菌数与p H9.0时差不多,但当培养基的p H升至10.0时,菌数急剧减少.这与西湖水体的自然情况相吻合.

18、西湖水体年平均p H为8.42,夏秋季可达10.0左右,最低的1月份也在7.5以上9.如果人为调低湖水的p H,细菌的最大可能生长量会有一定程度的增加,p H7.1时比p H8.8的自然水体最大生长量可增加2倍(表4.Mayo7认为异养细菌在p H4.05.5的水体中密度最大,看来湖水的高p H确实在一定程度上限制了异养细菌的数量.Cavallo等1认为,细菌密度在温度较高的夏季比较大,而我们发现西湖水体中许多微生物类群如异养细菌、纤维素分解菌、氨氧化细菌、硝酸盐还原菌等的数量在温度较高的夏秋季反而比冬春季要少15,p H偏高可能是其中一个重要的原因.表3西湖水体中异养细菌的耐碱性T able

19、3Alk ali endurability of the heterotrophic b acteria in the West Lake,H angzhou(×103cfuml-1项目Item培养基MediapH7.0pH8.0pH9.0pH10.0异养细菌数Heterotrophic bacteria 1.58±0.18 1.12±0.35 1.55±0.230.07±0.02表4pH对水体异养细菌最大生长量的影响T able4E ffect of pH on the largest grow th potential of heterot

20、rophic b acteria(×105cfuml-1项目Item水体WaterpH8.8pH7.7pH7.1pH6.3pH5.5异养细菌最大生长量 1.98±0.374.26±0.526.08±0.234.73±0.763.54±0.63 Heterotrophic bacteria316在自然培养下的异养细菌生长及组成考虑到自然情况下水体中的微生物种群较复杂,而且纯种培养的接种量不易控制,我们在尽可能与自然环境一致的情况下进行了培养试验.由图3、4可以看出,自然培养的结果与纯种培养基本一致,对细菌生长的影响大小皆为:牛肉膏>

21、;葡萄糖>N >P.另外还发现在自然水体中添加0.5%葡萄糖后细菌的最大生长量(光密度比用纯种培养法培养时要高,且能形成许多具丰富黏液的絮状菌胶团.在显微镜下观察菌胶团发现,除了一些长杆菌、弧菌和芽孢菌外,50%以上是一类短而粗的球杆菌,细胞相当大,无芽孢,常成对排列在一起,也有3、4个堆在一起的,有的具孢囊,革兰氏染色呈阴性,经平板分离,它在无氮培养基上生长良好,说明是一类自生固氮细菌2,5,很可能是固氮菌属(A zotobacter sp.这一结果进一步证明,在有充足碳源的前提下,氮限制了异养细菌的生长.另外,在添加C、N、P的混合组中发现光密度增加特别多,肉眼可见许多丝状物,

22、经显微镜检查发现有大量霉菌生长,从而推断湖水并不缺少矿质元素;添加0.01%牛肉膏后假单胞菌属 (Pseudomonas的细菌有显著的增加.以前测定15图3添加不同营养物对湖水自然培养的影响Fig.3Effect of different nutrients on bacteria gorwth of West Lake wa2 ter.1对照Control,20.1%KH2PO4,30.1%(NH42SO4,40.5%萄萄糖G lucose,50.01%牛肉膏Beef extract,60.1%牛肉膏Beef ex2 tract.下同The same below.图4营养因子对自然培养水体光

23、密度的影响Fig.4Effect of nutrient factors on the OD in the natural culture.7混合组0.1%KH2PO4+0.1%(NH42SO4+0.5%glucose.54318期吴根福等:杭州西湖水体中异养细菌生长的限制因子 及本次实验结果表明,西湖水体中假单胞菌属细菌约占异养细菌总数的30%,添加0.01%牛肉膏后,这个比例上升到57%,而添加0.1%牛肉膏后,假单胞菌只占5%左右.这说明在提供少量营养物质后,营养要求较简单的假单胞菌属细菌优先获得了这些营养,当提供的营养较丰富时,一些营养要求相对较高,生长速度快的微生物才大量繁殖.317

24、西湖水体中异养细菌的最大可能生长量从表2及图3可明显看出,西湖水体中异养细菌的最大可能生长量达105个ml-1,而自然水体中异养细菌只有103个ml-1,其原因可能是在黑暗处培养,藻类死亡,增加了微生物可利用的营养;在自然水体中藻类生长十分旺盛,可能会分泌某些物质来抑制微生物的生长10,也可能是这些藻类的生长吸收了周围环境中的营养盐,从而使微生物可利用的营养物质的含量下降.另外水体中浮游动物生物量较高,十分活跃,它们的存在会吞噬一些微生物,导致微生物数量减少.从实验室培养情况看(表5,浮游动物对异养细菌的影响较为明显.添加浮游动物后,异养细菌数比对照减少了81%,含藻类的西湖水(未经过滤,也含

25、有浮游动物只比对照减少48%.而现场调查16却表明,异养细菌(Y与叶绿素a(X1的负相关比浮游动物(X2要显著:Y=-131X1+13016(r=-0.7641;Y=-1405X2+ 4031(r=-0.5439.这可能与实验室培养时缺乏藻类,浮游动物大量吞噬细菌有关.表5藻类和浮游动物对异养细菌生长的影响T able5E ffect of phytoplankton and zooplanktons on grow th of het2 erotrophic b acteria(×105cfuml-1处理Treatment 藻类的影响Having phytoplankton3黑暗培

26、养In dark光照培养In light浮游动物的影响Having zooplankton33对照Control添加浮游动物Adding zooplankton异养细菌HB 1.40±0.250.73±0.18 5.12±0.690.96±0.27 3Cultivated in25,33Cultivated in34,HB:Heterotrophic bacteria.参考文献1Cavallo RA,Rizzi C,Vozza T,et al.1999.Viable heterotrophicbacteria in water and sediment

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