急性肝损伤动物模型制备研究进展_张琪

1、文章编号 :1673-2995(2011 04-0216-05·综 述 ·急性肝损伤动物模型制备研究进展Progress study of animal models of acute hepatic injury张 琪 1, 陈 辉 2, 彭顺利 1, 白 杨 1综述 , 钟秀宏 3*审校 (吉林医药学院 :12009级临床本科甲班 , 22008级 临床本科班 , 3病理学教研室 , 吉林 吉林 132013摘 要 :肝脏疾病是影响人类健康的最为常见疾病之一 , 而各种肝脏疾病的发病机制的研究与治疗药物的筛 选 , 在很大程度上依赖于人类肝脏疾病病理机制相似的试验动物模

2、型的建立和应用 。 现在就试验性急性肝损 伤动物模型的分类 、 造模方法 、 机制等进行相关的阐述 。关 键 词 :肝损伤 ; 异烟肼 ; 四氯化碳 ; 雷公藤 ; 造模方法中图分类号 :R-332文献标识码 :A肝脏疾病是影响人类健康的最为常见疾病之一 。 各种有害因素导致的肝损伤主要有病毒性肝炎 、 酒精 性肝炎和药物性肝炎等类型 , 其临床表现为肝坏死 、 脂肪肝 、 胆汁淤积 、 肝纤维化 、 肝硬化以及肝癌等 。 目 前 , 对肝损伤的治疗仍是一个全球性的严峻课题 , 而 各种肝脏疾病的发病机制的研究与治疗药物的筛选 , 在很大程度上依赖于人类肝脏疾病病理机制相似的 试验动物模型的建

3、立和应用 。 现在就试验性急性肝 损伤动物模型的分类 、 造模方法 、 机制等进行相关的 阐述 。1四氯化碳 (CCl4引起的肝损伤11造模方法常用大鼠和小鼠进行急性肝损伤的造模 。 大鼠 造模 :大鼠体重为 200 250g , 常规饲养 , 按 10mL / kg 容量 , 大鼠 1次性腹腔注射体积分数为 01%, 或灌胃 01% 02%, 或皮下注射 05%的 CCl4油溶 液 , 染毒 12 24h 后处死大鼠 1。 小鼠造模 :小鼠体 重为 20 25g , 常规饲养 , 按 10mL /kg经小鼠腹腔注射 , 一次给予 0125%、 025%、 05%、 10%CCl 4溶 液 ,

4、 12 24h 后处死 , 均可制造小鼠急性肝损伤模 型 。 其中 0125%cq 腹腔注射制造的小鼠急性肝损 基金项目 :吉林医药学院大学生科研基 金 资 助 项 目 (吉 医 学 科 字 2010第 3号 作者简介 :张 琪 (1990 , 女 (汉族 , 在读本科 通讯作者 :钟秀宏 (1971 , 女 (畲族 , 副教授 , 硕士 伤模型 , 可应用于保健食品护肝功能的筛选 2。 根 据张孝卫 3等人的研究发现 , 大鼠的 CCl4肝损伤模 型具有良好的稳定性和重现性 。12机 制近年来 , 一致认为 CCl4肝毒的主要机制为自由基的形成及引发的链式过氧化反应 。 CCl4的代谢产 物

5、能迅速与细胞成分发生不可逆的共价结合而导致 细胞死亡 。 特别是自由基作用于 DNA 时 , 直接破坏 核酸 , 引起 DNA 断裂或 DNA 与蛋白质交联 , 影响其信息传递以及转录和复制 。 在 CCl4引起的脂质过氧 化物和共价结合的双重作用下 , 导致膜脂质流动性降 低 、 钙泵抑制 、 谷胱甘肽活性抑制 、 线粒体功能丧失 、 肝细胞内钙稳态失调及代谢紊乱 , 引起肝细胞损伤加 剧 4。CCl4所致急性肝损伤动物模型形态学一般表现 为肝小叶中央区坏死和脂肪变性 , 血清学指标为丙氨 酸氨基转移酶 (ALT 、 天门冬氨酸氨基转移酶 (AST 升高 。 还可以测定反映肝脏功能的血清学的

6、指标 , 如 总胆红 (TB 、 总蛋白 (TP 、 白蛋白 (A 、 白球蛋白比 值 (APG 及 组 织 病 理 学 检 查 , 肝 匀 浆 脂 质 过 氧 化 (LPO 或丙二醛 (MDA 、 超氧化物歧化酶 (SOD 、 谷 甘肽过氧化物酶 (GSH-Px 或还原性谷胱甘肽 (GSH 等有关指标 。2氨基半乳糖肝损伤21造模方法常用大鼠和小鼠进行造模 , 将氨基半乳糖用生理 612 第 32卷 第 4期2011年 08月吉 林 医 药 学 院 学 报Journal of Jilin Medical CollegeVol32No4 Aug2011盐水配制成 10%溶液 , 并用 1mmo

7、l /LNaOH 将 pH 调 至 70, 一次性腹腔注射 600 900mg /kg, 24 48h 后处死 。 顾呈华 5等人曾用 ICR 小鼠进行急性尾静 脉注射氨基半乳糖诱导小鼠肝损伤模型 , 发现具有染 毒特异性高 、 剂量 -效应关系好 、 指标特异性和灵敏度 高等特点 , 是较理想的肝损伤造模方法 。22机 制氨基半乳糖是一种肝细胞磷酸尿嘧啶核苷干扰 剂 , 能竞争性捕捉 UTP 生成二磷酸尿苷半乳糖 , 使磷 酸鸟苷耗竭 , 导致物质代谢严重障碍 , 引起肝细胞变 性 , 解毒 机 制 障 碍 更 加 剧 了 氨 基 半 乳 糖 的 毒 性 作 用 6。 若反复多次给药能诱发动

8、物肝纤维化的慢性 肝损伤及癌变 。 其形态学表现为弥漫性的多发性片 状坏死 , 脂肪变性不明显 , 细胞内呈现大量的 PAS 染 色阳性的毒性颗粒 , 嗜酸性小体较多见 , 与病毒性肝 炎造成的肝损伤类似 , 因此常用于肝炎药物的研发 。 氨基半乳糖肝损伤模型是目前公认的比较好的研究 病毒性肝炎的发病机制及有效治疗药物的实验动物 模型 。3异烟肼性肝损伤31造模方法家兔对异烟肼敏感 , 故常选用家兔建立异烟肼性 肝损伤模型 。 先经皮下注射 0135mmol /kg剂量的 异烟肼后 , 再每隔 4h 皮下注射 0128mmol /kg剂 量 , 2d 即可成功建立急性肝损伤模型 7。 禄保平

9、等 8采用 180mg /kg剂量异烟肼灌胃 18h 后也可成 功建立该模型 , 并认为其肝损伤机制与自由基脂质过 氧化反应有关 。 也有学者 9联合运用异烟肼和利福 平建立药物性肝损伤模型 。32机 制异烟肼是常用的抗结核病药 , 具有肝毒性 , 多用 于药物性肝炎的研究 。 异烟肼进入肝细胞 , 首先形成 乙酰化异烟肼 , 并快速水解为联胺 , 联胺在细胞色素 P450的作用下 , 被氧化为无毒且具有活性的乙酰化 异烟肼 , 乙酰化异烟肼一方面经过乙酰化形成二乙酰 异烟肼随尿液排出 ; 另一方面与肝蛋白通过共价键结 合而导致肝脏损害 。 另外在酰胺酶作用下 , 乙酰化异 烟肼可被代谢成联胺

10、 , 导致肝脏损害 , 引起血清中转 氨酶和精氨琥珀酸裂解酶明显升高 ; 肝细胞变性 、 坏 死 、 汇管区炎症 、 中央静脉淤血明显增高 。 异烟肼引 起的肝损害是可以预防的 , 保肝药物可有效减轻损肝 药物的肝毒性 。 保肝药物宜早期介入 , 否则 , 损肝药 物应用时间越长 , 肝损伤程度越重 , 则保肝药物的干 预效果越差 。4对乙酰氨基酚肝损伤41造模方法将对乙酰氨基酚溶于 40 无菌生理盐水 , 给小 鼠 300 500mg /kg一次性腹腔注射 ; 配成质量浓度 为 25%混悬液经小鼠口灌胃 , 染毒 24h 后处死动 物 , 以上两种方法均可制成肝损伤模型 1。42机 制对乙酰

11、氨基酚又名扑热息痛 、 醋氨酚 , 为常用的 解热镇痛药 , 小剂量不会引起肝损伤 , 当大剂量使用 时 , 会造成不同程度的肝损伤 。 其与葡萄糖醛酸或硫 酸结合 饱 和 后 , 剩 余 的 对 乙 酰 氨 基 酚 经 细 胞 色 素 P450代谢生成过量的对乙酰基苯醌 , 对乙酰基苯醌 能与谷胱甘肽结合解毒 ; 但当谷胱甘肽含量不足时 , 过剩的对乙酰基苯醌与肝细胞构成蛋白形成共价键 结合而导致肝细胞损伤 。 乙酰基苯醌肝损伤动物模 型多用于因各种原因导致谷胱甘肽含量减少而引起 肝细胞损伤的治疗药物筛选 。 它是常用的药物性肝 损伤模型 , 形态学主要表现为以中央静脉为中心的圆 盘状大量细

12、胞坏死 , 但出血和脂肪变性不明显 。 此模 型对小鼠十分敏感而对大鼠不敏感 10。5卡介苗和脂多糖诱导的肝损伤51造模方法一般采用小鼠体重为 25 30g , 用生理盐水配制 卡介苗 (BCG 溶液 , 使每毫升含 108个活菌 , 经尾静 脉注射 02mL (25mg BCG 溶液 。 10d 后经尾静脉 注射 02mL (10g 脂多糖 (LPS 生理盐水溶液 , 16h 后采血和取肝组织 11。52机 制此模型的原理是预先给小鼠注射 BCG , 激活致 敏 T 淋巴细胞 , 尤其是致敏肝内库普弗细胞和巨噬 细胞 , 使其聚集于肝脏 。 之后再用低剂量大肠杆菌 LPS 攻击注射 , 可激

13、发这些细胞因子释放对肝细胞有 毒性作用的可溶性因子 , 如一氧化氮 (NO 、 肿瘤坏死 因子 (TNF 、 白细胞介素 、 自由基 、 白三烯等造成肝细 胞损害 , 从而导致免疫性肝损伤 。 此模型可致血清 ALT 、 AST 值升高 , 注射 LPS 12h 后达到高峰 , 肝脏病 712第 4期 张 琪 , 等 急性肝损伤动物模型制备研究进展理学变化以肉芽肿性炎症浸润为主 , 可见中度或重度 炎性细胞浸润 , 存在大量的点状坏死 、 小灶性坏死及 灶性纤维化 , 还可见细胞凋亡小体 。 BCG 加 LPS 肝 损伤模型造成的肝损伤与病毒性肝炎发病机制有较 大的相似 , 因此常用此模型研究

14、病毒性暴发性肝炎 。6雷公藤肝损伤模型61造模方法禄保平等以 270mg /kg剂量雷公藤多苷配制成 混悬液 , 按 02mL /10g 体重进行小鼠灌胃 1次 , 18h 后处死 , 成功建立小鼠急性肝损伤模型 12。62机 制雷公藤属卫茅科雷公藤属植物 , 具有祛风除湿 、 活血通络 、 消肿止痛 、 杀虫解毒等功效 。 针对其肝脏 损害的特点 , 近年来国内学者开展了应用其提取物诱 导实验性肝损伤的研究 。 禄保平等以雷公藤多苷配 制混悬液进行小鼠灌胃致急性肝损伤 , 研究显示小鼠 血清 ALT 、 AST 升 高 , SOD 和 GSH-PX 水 平 降 低 , MDA 、 IL-18

15、水 平 升 高 。 肝 细 胞 出 现 显 著 的 脂 肪 变 性 、 水肿 (气球样变 及散在的嗜酸性变 。 认为雷公 藤多苷所致的急性肝损伤与自由基脂质过氧化反应 及 IL-18有较大关系 。 IL-18能够诱导产生多种与肝 细胞损害有关的细胞因子 , 并能增强 FasL 的表达 , 而 Fas-FasL 系统与某些肝损害也密切相关 。 实验还表 明 , 雷公藤多苷能够通过各种途径诱导小鼠肝细胞发 生凋亡 。 由于临床应用中药或其提取物进行模型研 究的几乎没有 , 所以用雷公藤建立的药物性肝损伤模 型作为以中药建立肝损伤模型的代表 。7四环素肝损伤模型71造模方法禄保平等以 2250mg

16、/kg剂量四环素片配制成 混悬液 , 按 02mL /10g 体质量灌胃 1次 , 成功建立 小鼠急性肝损伤模型 。 孙创斌等以小鼠腹腔注射 23g /(kg ·d 四环素 4d , 造成四环素脂肪肝动物模 型 。72机 制四环素是一种临床运用较久的抗生素 , 国内外文 献研究表明 , 四环素类抗生素可引起严重的肝损害 。 用药剂量大 、 静脉注射 、 肾功能不全时可引起血药浓 度过高 , 造成致死性肝脏急性脂肪变性 。 通过研究显 示 , 四环素引起的肝损伤造成血清中 ALT 、 AST 水平 升高 , 肝细胞出现的脂肪变性和水肿 , 肝窦变窄或消 失 , 肝细胞广泛损伤 , 细胞

17、超微结构显著变化 。 四环 素所致急性肝损伤与自由基脂质过氧化反应关系不 大 , 与 IL-18有较大关系 , 但仍需在今后进一步研究 确定 13。8硫代乙酰胺肝损伤81造模方法魏新智 14等采用一次性腹腔注射硫代乙酰胺 200mg /kg, 发现在给药后 24h 急性肝损伤最明显 。 82机 制一次性腹腔注射硫代乙酰胺可导致急性肝炎 , 反 复腹腔注射可导致肝细胞坏死 、 再生结节形成 、 毛细 胆管增生 、 门静脉高压而导致肝硬化 。 TAA 引起的 急性肝损伤表现为血清 ALT 、 AST 值显著升高 , 病理 学显示肝细胞变性坏死 , 肝脏病理变化均一 。 硫代乙 酰胺诱发的肝硬化被认

18、为与人肝硬化的病理组织学 相似 , 其肝硬化模型可用于治疗肝硬化药物的研发 。9氯化钴肝损伤91造模方法一般先在小鼠腹部涂 1%的氯化钴乙醇液 , 然后 用 04%氯化钴橄榄油溶液进行肝穿刺 。92机 制氯化钴引起肝损伤主要是氯化钴作为抗原攻击 肝脏后 , 其抗原信息从肝脏被传递至外周淋巴细胞 , 促进其表面淋巴细胞功能相关抗原 (LFA-1 分子的 表达 , 抗原分子阳性的细胞随后浸润肝脏 , 通过免疫 反应从而导致肝细胞损伤 , 引起血清转氨酶升高和肝 组织脂肪变性 、 肝细胞坏死 、 炎性细胞浸润 。 氯化钴 造成肝损害时浸润的 T 细胞通过表面淋巴细胞功能 相关抗原和表面细胞间粘附分子

19、 (ICAM-1 相互作用 而释放毒性物质 , 这些毒性物质也可直接导致肝损 伤 。 氯化钴肝损伤动物模型引起肝脏损害可持续数 月 , 与慢性肝炎迁延的特征和免疫调节类似 。 氯化钴 引起肝损伤动物模型多用于模拟临床肝炎的慢性化 过程 。812 吉林医药学院学报 2011年 08月 第 32卷10酒精性肝损伤101造模方法一种造模方法是用 56度白酒灌胃 , 大鼠每千克 体重每次 7mL , 小鼠每千克体重每次 16mL , 每日 2次 , 1 10d 。 另一种是以 50 60度白酒或体积分数 为 50% 60%的乙醇一次性每千克体重经口灌胃 40 60g , 4 24h 内取血和肝组织 。

20、102机 制乙醇进入机体后 , 在乙醇脱氢酶催化下 , 氧化为 乙醛和乙酸盐 , 使三羧酸循环障碍和脂肪酸氧化减弱 而影响脂肪代谢 ; 乙醛又能和细胞内大分子如蛋白 质 、 DNA 形成复合物 ; 乙醛的产生以及乙醇刺激肾上 腺素的释放 , 还可引起肝脏血管收缩 , 肝窦内压升高 或肝组织缺氧 , 导致肝细胞空泡变性 。 急性酒精性肝 损伤模型以肝脏和血液中的某些化学指标改变为主 要特征 , 如肝组织中丙二醛含量显著增加 , 血清中甘 油三酯明显升高 , 但血清中转氨酶和肝组织结构病变 却不明显 。11刀豆蛋白 A 诱导的肝损伤111造模方法常用 Balb /c小鼠 , 体重 20 30g ,

21、 将刀豆蛋白 A (ConA 用 PBS 或生理盐水稀释 , 以每千克体重 20mg 一次性尾静脉注射给药后 , 可制作成急性肝损伤模 型 6。112机 制应用 ConA 诱发小鼠特异性肝损伤模型是近年 来新发展起来的由 T 淋巴细胞介导的肝损害 , 它的 建立和应用为深入研究肝细胞损害的细胞学与分子 学机制以及进行治疗药物筛选提供了更为方便和理 想的试验动物模型 。 ConA 是植物凝集素 , 有促进有 丝分裂的作用 , 可以引起 T 细胞介导的肝损伤 , 当 ConA 进入小鼠体内 , 其活性代谢产物结合蛋白侵入 免疫系统而导致肝细胞坏死 。 此后 , 药物修饰蛋白逸 出细胞外 , 被库普

22、弗细胞 、 巨噬细胞 、 肝血窦内皮细胞 及 B 细胞等抗原提示细胞吞噬 , 在细胞内分解小分 子肽 。 肽分子在细胞表面表出 , 就会被 T 细胞分化 群 (CD4+T 细胞所识别 , 通过一系列免疫反应导致 肝细胞破坏 。 小鼠每千克体重静脉注射 ConA 20mg 后 , 6 8h 可见肝细胞凋亡坏死和明显的淋巴细胞 浸润 , 肿瘤坏死因子 -、 干扰素 -等细胞因子血清水 平升高 。 注射 ConA 后 , 8h 血清 AST 明显升高 , 病理 形态学改变为肝小叶有严重的中性粒细胞 、 淋巴细 胞 、 单核细胞浸润 , 炎症病灶在门静脉区和中央静脉 区尤为明显 , 电镜显示弥漫性肝细

23、胞坏死 。 ConA 诱 发的肝炎与炎性细胞因子的产生有密切关系 。 ConA 肝损伤动物模型对于治疗自身免疫性肝炎的药物筛 选具有重要意义 。12脂多糖和死菌性肝损伤121造模方法一般采用 10mg 死菌和 11g LPS 给大鼠依次 注射 6d 后可诱发急性肝损伤 。 单独一次性注射死 菌可导致大鼠重症肝炎 , LPS 加死菌二者可协同导致 严重的肝损害 7。122机 制LPS 和死菌所导致的重症肝炎与人的重症肝炎 在病理形态学方面具有相似性 , 该模型被广泛用于肝 炎的研究 。 LPS 对肝脏损害的主要机制是通过库普 弗细胞和巨噬细胞释放炎性细胞因子攻击肝细胞而 诱发急性肝炎 。 当 L

24、PS 被吸收入血 , 随门静脉血流 进入肝脏 , 肝脏对 LPS 产生生物滤过作用 , 即肝血窦 中库普弗细胞吞噬脂多糖而防止进入体循环 , LPS 促 进库普弗细胞释放 TNFa 、 IL-6等而诱发急性肝炎 , 同 时抑制葡萄糖 -6-磷酸酶的活性 , 从而抑制糖异生及 胆红素的输送导致黄疸 , LPS 还可激活补体系统 , 诱 发内因性血凝固而导致肝脏损害 。13其 他手术肝损伤 15主要用于急性肝功能衰竭模型研 究肝移植 、 细胞移植和人工肝治疗效果 , 根据实验动 物的不同术式较多 。 部分肝切除 、 全肝切除术仅适合 肝移植肝切除后到供肝行使功能期间的研究 , 亦有采 用门腔端 -

25、侧分流 、 胆总管结扎切断术建立了较理想 的犬急性肝功能衰竭模型 , 有望用于生物人工肝的研 究 。 陈钟采用 95%肝切除 , 术中经中叶肝静脉注入 5%葡萄糖氯化钠溶液 (10mL /kg体重 , 建立了较理 想的大鼠急性肝功能衰竭模型 , 并指出与传统手术方 法相比 , 经中叶肝静脉注入 5%葡萄糖氯化钠降低了 病死率 , 药物诱导肝衰竭法在肝细胞移植时药物可对 植入的肝细胞产生毒性损害 , 可能影响治疗 , 干扰实 验结果 。 单纯胆总管结扎 、 胆管内逆行性注入 N-丁 912第 4期 张 琪 , 等 急性肝损伤动物模型制备研究进展基 -2氰基丙烯酸盐加胆管结扎均可建立胆管阻塞性 肝

26、纤维化模型 , 且具有炎症反应轻 、 造模周期短 、 自发 逆转低 、 实验指标稳定等优点 。综上所述 , 制造实验性肝损伤动物模型的方法很 多 , 虽然近年来国内外有关肝损伤模型的研究取得了 显著进展 , 但由于肝脏功能复杂和肝损害因素的多样 性 , 任何一种实验模型都不能全面 、 准确地反应特定 肝损伤的本质 。 因此 , 肝损伤动物模型还需要进一步 完善 , 肝损伤的机制复杂 , 尚待进一步研究 。参考文献 :1于 强 , 于 洋 肝损伤动物模型及中药治疗研究概况 J 中国现代中药 , 2006, 8(11 :25-282赵 敏 , 杨杏芬 , 池莉平 , 等 小鼠急性四氯化碳肝损伤 模

27、型的建立及在保健食品筛选中的应用 J 华南预防 医学 , 2002, 28(5 :5-83张孝卫 , 耿秀兰 , 黄丽华 , 等 四氯化碳致大鼠 、 小鼠肝损 伤的对比实验 J 基础医学与临床 , 2003, 23(3 :351-3524Shiga A , Kakamu S , Sugiyama Y , et alAcute toxicity of pierisin-1, a cytotoxic protein from Pieris rapae , in mouse and rat J J Toxicol Sci , 2006, 31(2 :123-1375顾呈华 , 朱宝立 , 徐 军 ,

28、 等 D-半乳糖诱导小鼠肝损伤 模型的方法研究 J 职业与健康 , 2009, 25(22 :2364-23666陈雪龙 实验性肝损伤动物模型的研究进展 J 实验动物科学 , 2008, 25(3 :47-497王福根 , 孙静霞 肝损伤动物模型的建立和应用 J 中 国药房 , 2006, 17(9 :702-7038禄保平 , 杨晓娜 , 许家艳 异烟肼灌胃建立小鼠急性肝损 伤模型的研究 J 中国医药生物技术 , 2007, 2(4 :286-2909薛洪源 , 侯艳宁 , 刘会臣 , 等 黄芩苷对异烟肼和利福平 肝损害小鼠的保护作用 J 解放军药学学报 , 2003, 19 (6 :414-41710齐艳萍 , 李和 平 急性肝损伤动物模型制备的概 述 J 甘肃畜牧兽医 , 2008, 38(2 :37-3911杨舒淳 , 杨昌华 , 马小凡 , 等 小鼠腹腔注射卡介苗加脂 多