荧光标记寡核苷酸的反相离子对色谱分析

1、荧光标记寡核苷酸的反相离子对色谱分析    A useful trade is a mine of gold.                      作者：黎朋 王晶 高运华 武利庆 盛灵慧 傅博强  【摘要】  建立荧光标记寡核苷酸反相离子对色谱分析方法

2、，优化了流动相醋酸三乙胺浓度（00.15 mol/L）, pH 4.57.0和洗脱强度等色谱条件。对5mer, 10mer和15mer非标记和5羧基荧光素（5FAM）标记寡核苷酸的保留进行比较分析，研究荧光标记寡核苷酸的保留机理，并分离TaqManTM探针等多种常用荧光标记寡核苷酸。结果显示，不同长度荧光标记寡核苷酸在0.01 mol/L醋酸三乙胺，pH 7.0的条件下获得最大分离。荧光标记寡核苷酸的保留与非标记寡核苷酸有明显差异，两者可完全分离()。在一定长度范围内非标记寡核苷酸随长度的增加，保留时间增长；相反，荧光标记寡核苷酸的长

3、度增加，保留时间减短。荧光染料疏水性对其标记的寡核苷酸在反相柱中的保留有较大影响，荧光染料疏水性越强，其标记寡核苷酸保留时间越长。但疏水性的影响程度随标记寡核苷酸长度增加而逐渐变小。   【关键词】  荧光标记寡核苷酸， 荧光染料， 反相离子对色谱， 保留1  引言    人类基因组计划的完成促进了以核酸为基础的临床诊断、法医DNA鉴定、检验检疫技术的发展，因此核酸的定性与定量分析变得越来越重要。荧光标记检测技术的诞生极大促进了核酸测量技术的发展，该技术正逐渐取代传

4、统同位素标记技术13，在核酸测量中广泛应用。荧光标记寡核苷酸作为荧光技术中的重要工具，已应用于医学、农业、环境和生物学等领域，如实时荧光定量聚合酶链反应（Realtime PCR）中最常见的TaqManTM探针4、基因表达谱芯片分析中用荧光染料Cy3和Cy5标记的探针5、DNA测序6、基因分型和荧光原位杂交（FISH）中的多荧光标记寡核苷酸等。在新一代检测技术（如数字PCR（Digital PCR）7和单分子测量8等）中，荧光标记寡核苷酸也非常重要(医药学/临床医学论文 )。高新技术和广泛领域的应用对荧光标记寡核苷酸的质量控制、纯度和量值准确提出了更高的要求。 &

5、#160;  目前，非标记寡核苷酸的分离纯化分析方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、阴离子交换色谱（AEC）、毛细管凝胶电泳（CGE）和反相离子对高效液相色谱（IPRPHPLC）等，IPRPHPLC因具有快速、高灵敏度和分离效果好等特性而普遍应用9。虽然对寡核苷酸IPRPHPLC分析方法的研究较多1012，但对荧光标记寡核苷酸分析的研究报道较少，特别是保留机理方面的研究更少，主要为纯化方法13,14。与非标记寡核苷酸相比，荧光标记寡核苷酸的IPRPHPLC保留和分离机理更复杂，影响因素更多，不仅要考虑离子对效应，而且要考虑荧光染料本身的疏水性影响。本研究从寡核苷酸组成、

6、不同荧光染料标记等方面研究了非标记寡核苷酸和荧光标记寡核苷酸样品在IR上的分离情况，研究其保留机理，优化IPRPHPLC分析条件，建立荧光标记寡核苷酸的IPRPHPLC分析方法。2  实验部分Nightingales will not sing in a cage.  2.1  仪器与试剂    安捷伦1200液相色谱仪（Degasser/Quat Pump/ALS/TCC/DAD）；Synergi HydroRP色谱柱（250 mm×4.6 mm,

7、60;4 m，美国Phenomenex公司）。乙腈（ACN，色谱纯，SigmaAldrich公司）；三乙胺（TEA，99%，SigmaAldrich公司）；乙酸（AA，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；醋酸三乙胺（TEAA）溶液由三乙胺和乙酸配制；实验用水经MilliQ超纯水系统纯化。Good counsel never comes too late.  2.2  样品的设计    为考察不同寡核苷酸和荧光标记寡核苷酸样品在色谱上的分离条件，研究保留机理，设计了相同组成和长度，不同荧光染料标记寡核苷酸的样品；不同

8、组成和长度，同一荧光标记寡核苷酸的样品，具体样品设计见表1。所有测试样品由上海英骏生物技术有限公司（Invitrogen）合成，PAGE纯化。Every man has his hobby-horse.  表1  实验用寡核苷酸与荧光标记寡核苷酸（略）It is right to put everything in its proper use.  Table 1  Oligonucleotides and fluorescent dyelabeled oligonucleotides

9、 used in this study*： FAM, 5羧基荧光素（5arboxyfluorescein，5FAM）; Cy3, 花青3（yanine3）; Cy5, 花青5（yanine5）; FITC, 异硫氰荧光素（luorescein isothiocyanate）; TAMRA, N,N,N,N四甲基6羧基罗丹明（N,N,N,Netramethyl6carboxyrhodamine）; JOE： 2,7二甲氧基4,5

10、二氯6羧基荧光素（2,7imethoxy4,5dichloro6carboxyfluorescein）; HEX, 6羧基2,4,4,5,7,7六氯荧光素（6arboxy2,4,4,5,7,7hexachlorofluorescein）。   2.3  分析样品的制备3  结果及讨论Beg from beggers and you'll never be rich.  3.1  荧光标记寡核苷酸分离的色谱条件    目前，分析非

11、标记寡核苷酸主要采用IPRPHPLC方法。该方法中流动相的pH值、离子对浓度和初始有机相比例为主要影响因素1012。本实验的流动相采用离子对试剂醋酸三乙胺（TEAA）和乙腈。实验表明，荧光标记寡核苷酸的分析条件与非标记寡核苷酸不同。TEAA浓度对分离的影响见图1A。在0.01 mol/L TEAA的条件下，实验样品的分离度R最大；随着TEAA浓度增大，R逐渐减小；当TEAA浓度大于0.05 mol/L时，分离效果欠佳（R1.5）。与非标记寡核苷酸的分析条件TEAA浓度为0.05或 0.1 mol/L15,16相比，荧光标记寡核苷酸的分离需要低浓

12、度的TEAA（0.01 mol/L）。推测是由于增大TEAA浓度会引起更强的离子对效应，保留时间增加，从而弱化不同长度样品间疏水性差异对保留时间的影响，导致各样品的保留时间逐渐接近，分离效果变差。    根据色谱柱适用条件选择pH 4.57.0作为实验范围（图1B）。当pH=7.0时，各样品分离效果最好；降低pH 值，样品的分离度下降。主要是因为在低pH值条件下，TEAA体系解离度增大，TEA+浓度增加，效果与图1A中增大TEAA浓度类似，进一步增强离子对效应，导致分离度下降。从图1中还可以发现，相同条件下，R1>R2

13、>R3，即R5mer/10mer>R10mer/15mer>R15mer/20mer，随着荧光标记寡核苷酸样品长度的增加，分离效果逐渐变差。分离不同长度荧光标记寡核苷酸可选择条件0.01 mol/L TEAA，pH 7.0；如需对非标记和荧光标记寡核苷酸进行分离比较，可考虑选择0.05 mol/L TEAA。初始洗脱强度是影响非标记寡核苷酸分析的关键因素，但荧光标记寡核苷酸分析对此条件要求不高，可根据实际样品和色谱柱选择适宜的初始洗脱强度。柱温、洗脱梯度和流速对样品分离效果的影响程度较小。  图1 

14、; TEAA浓度（）和pH值（）对荧光标记寡核苷酸分离度的影响（略）Great winds blow upon high hills.  Fig.1  Effect of triethylamineacetic acid(TEAA)（） and pH value(B) on resolution of fluorescent dyelabeled oligonucleotides1. L1/L2； 2. L

15、2/L3； 3. L3/L4。色谱条件（Conditions）：流速（Flow rate）0.8 mL/min；pH 4.57.0；流动相（Mobile phase）A：00.15 mol/L TEAA，流动相（Mobile phase）B：100% ACN；柱温（Temperature）40 ；洗脱梯度（Gradient）10%22% B，0.4% B/min；检测波长（Detection wavelength）： 260 nm。3.

16、2  寡核苷酸与荧光标记寡核苷酸的分离    非标记寡核苷酸与荧光标记寡核苷酸的分离见图2，既使两者的长度和序列相同， 也可完全分离。这是因为大多数荧光染料的疏水性远大于寡核苷酸的疏水性13，导致前者在反相液相色谱（RPHPLC）中的保留明显强于后者。由图2还可看出，不同长度荧光标记寡核苷酸的色谱保留行为与寡核苷酸完全相反。采用5端序列相同、长度不同的非标记与5FAM标记寡核苷酸进行比较，非标记寡核苷酸的保留时间顺序为5mer10mer15mer。据文献分析主要是由离子对效应造成的保留时间差异，随着寡核苷酸长度的增加，保留时

17、间增大12。然而相同分析条件，不同长度5FAM荧光标记寡核苷酸的保留时间顺序为15mer10mer5mer，与非标记寡核苷酸的保留顺序完全相反。这与Fountain等14用合成保护基DMT修饰不同长度短链寡聚dT（8mer）的分析结果相似。随着荧光标记寡核苷酸长度的增加，保留时间却减少，可用荧光染料疏水性的影响来解释。采用RPHPLC分析时，疏水性强的分子在固相中分配比例大，具有较大的容量因子，保留时间长；而疏水性弱的分子则相反，保留时间短。荧光染料FAM与寡核苷酸相比具有更强的疏水性，当FAM标记的寡核苷长度很短时，其疏水性主要是由FAM决定，因此整个分子的疏水性较强；随着标记的寡核苷酸长度

18、增加，弱疏水性的核苷酸残基增多，整个分子的疏水性逐渐减弱，保留时间减少。长度越短的FAM标记寡核苷酸具有更强的疏水性，从而表现出更长的保留时间（图2）。实验表明，荧光染料疏水性的影响超过离子对效应。随着荧光标记寡核苷酸长度增加，分子疏水性减弱，疏水性对保留的影响减小，但长度的增加使离子对效应积累增大，导致分离度逐渐变小，验证了R5mer/10mer>R10mer/15mer>R15mer/20mer的实验结果。由此推测，当荧光标记寡核苷酸长度增至一定值后，离子对效应对保留的影响将大于疏水性，此时荧光标记寡核苷酸的保留顺序就会与非标记寡核苷酸相似。 图2 

19、0;不同长度的非标记寡核苷酸（a）与5FAM荧光标记寡核苷酸(b)的IPRPHPLC分离（略）Fig.2  Ionpair reversed phase high performance liquid chromatographic (IPRPHPLC) separation of different length unlabeled oligonucleotides(a) and 5FAM fluorescent&

20、#160;dyelabeled oligonucleotides（b）Everybody's business is nobody's business.  色谱条件（Conditions）： 流速（Flow rate）0.8 mL/min； pH 7.0；流动相（Mobile phase）A： 0.05 mol/L TEAA，流动相（Mobile phase）B： 100% ACN；柱温（Temperature） 40 

21、;；洗脱梯度（Gradient）10% B20% B，0.4% B/min；检测波长（Detection wavelength）： 260 nm。3.3  不同荧光染料标记寡核苷酸的分析    TaqManTM探针用于荧光标记寡核苷酸分析的色谱图见图3。样品保留时间顺序为N5L12（5FAM）L13（3TAMRA）L11（5FAM, 3TAMRA），同时标记FAM和TAMRA样品的疏水性最强，其保留时间最大，其它样品随着样品疏水性减弱，保留时间缩短。根据5FAM标记

22、寡核苷酸的荧光激发光谱其最大激发波长496 nm，可知该标记物不仅在260 nm有强吸收（核酸特征吸收波长），并且在496 nm也有强吸收，光谱扫描也证明了这一点（图3）。同样，3TAMRA标记寡核苷酸在556 nm有强吸收。因此采用FAM和TAMRA同时标记的TaqManTM探针在260， 496和556 nm都有强吸收。图3  TaqManTM探针的IPRPHPLC分离及光谱扫描（略）Fig.3  IPRPHPLC separation of TaqManTM&

23、#160;probe and online spectrum monitoring1. N5； 2. L12（5FAM）； 3. L13（3TAMRA）； 4. L11（5FAM, 3TAMRA）。色谱条件（onditions）：流速（low rate）0.8 mL/min； pH 7.0； 流动相（obile phase） A： 0.05 mol/L TEAA， 流

24、动相（obile phase）B： 100% ACN； 柱温（emperature） 40 ； 洗脱梯度（radient）11% 21% B， 0.4% B/min。这一特性可应用到液相色谱中，在没有荧光检测器的情况下，DAD检测器的多波长同时监测也可用于荧光标记寡核苷酸的分析，如TaqManTM探针及其降解产物的定性与定量检测。 图4  多种荧光标记寡核苷酸的IPRPHPLC分离（略）Fig.4  IPRPHPLC sepa

25、ration of diversified fluorescent dyelabeled oligonucleotides1. N4； 2. L5（5Cy3）； 3. L6（5Cy5）； 4. L7（5FITC）； 5. L8（5 TAMRA）； 6. L9（5 JOE）；7. L10（5HEX）。色谱条件同图3(The chromatographic conditions a

26、re the same as in Fig.3).检测波长（Detection wavelength）： 260 nm。    图4A为非标记与5Cy3和5Cy5标记寡核苷酸色谱图。由于三者具有明显疏水性差异，碳链更长的荧光染料Cy5的疏水性要强于Cy3，因此分离显著，保留时间顺序为N4L5（5Cy3）L6（5Cy5）。图4B为5FITC， 5TAMRA， 5JOE， 5HEX标记相同寡核苷酸的色谱图，保留时间顺序为N4L7（5FITC）L8（5

27、TAMRA）L9（5JOE）L10（5HEX）。此类荧光标记寡核苷酸多用于遗传分析、DNA测序和FISH等多荧光同时检测技术。【参考文献】  1 Lowry M, Fakayode S O, Geng M L, Baker G A, Wang L, McCarroll M E, Patonay G, Warner I M. Anal. Chem.,

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