雷帕霉素对糖尿病肾病大鼠病理结构及结缔组织生长因子表达的影响

1、雷帕霉素对糖尿病肾病大鼠病理结构及结缔组织生长因子表达的影响         10-09-12 16:46:00     作者：李琳琳 卢衡 郑祥雄    编辑：studa20【摘要】  目的 观察雷帕霉素对糠尿病肾病(DN)的保护作用。方法 应用链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型。24只SD大鼠随机分为3组：对照组、糖尿病组、雷帕霉素组。第5周起雷帕霉素组予雷帕霉素1 mg·kg-1·d-1干预8 w

2、。12 w末观察各组大鼠血糖、内生肌酐清除率(Ccr)、24 h尿微量白蛋白(24hUalb)、肾重/体重等的变化。光镜观察肾组织病理变化并测定肾小球平均体积及系膜基质扩张指数(EMMI)。RTPCR及免疫组化法检测肾皮质结缔组织生长因子(CTGF)mRNA及蛋白表达。结果 与对照组相比，糖尿病组及雷帕霉素组大鼠血糖、Ccr、24hUalb均显著上升,大鼠肾脏明显肥大，肾小球平均体积、EMMI、毛细血管基底膜厚度均显著增加;肾皮质CTGFmRNA及蛋白表达显著上调。雷帕霉素干预后，上述指标除血糖外均部分被抑制。结论 小剂量雷帕霉素能够减轻肾脏肥大，抑制系膜外基质聚集，下调CTGF的表达，延缓D

3、N的进展。 【关键词】  雷帕霉素;哺乳动雷帕霉素靶蛋白;结缔组织生长因子;糖尿病肾病糖尿病肾病(DN)是糖尿病的主要微血管病变，是糖尿病的主要死亡原因之一。早期DN主要表现为肾小球及肾小管的肥大、基底膜的增厚、细胞外基质(ECM)的异常聚集。结缔组织生长因子(CTGF)是转化生长因子1(TGF1)下游的一个生物效应因子，在DN肾小球肥大及ECM的异常聚集中均发挥重要作用。雷帕霉素是一种免疫抑制剂。近年研究提示，雷帕霉素对某些慢性肾脏疾病可能具有治疗的潜力。雷帕霉素能抑制单肾切除所诱导的残余肾脏肥大1，还能抑制系膜细胞增殖及型胶原的合成2。由于单侧肾切除所致代偿性肾肥大与糖尿病状态下

4、肾肥大具有一定相似性，并且系膜细胞的增殖及ECM的聚集都是DN发展的关键因素。因此，本课题拟用雷帕霉素进行干预治疗，观察其对早期DN病理变化的影响及对CTGF mRNA和蛋白表达的影响。1 材料与方法1.1 材料0003)。HRP多聚体(二步法免疫组化试剂)、DAB(均系北京中杉金桥生物技术公司产品);Trizol(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、10×缓冲液、dNTP(均系Fermentas公司产品);CTGF、actin引物(上海鼎安生物科技有限公司合成)。1.2 方法ProPlus6.0)计算每个正切肾小球的面积(AG)。利用公式计算其体积(

5、VG)。VG=(B/K)×(AG)1，3(B是理想化的球性肾小球系数B=1.38;K是肾小球大小分布系数，K=1.10)，最后求20个小球此比值的均数，即为每张切片肾小球的面积、体积值。同样方法下分析PASM切片，计算每张切片的系膜基质扩张指数(MMEI)MMEI=肾小球PASM染色阳性面积/肾小球正切面积。电镜观察肾小球滤过屏障及肾小管病变情况。1.3 统计学处理 数据以x±s表示，SPSS11.0软件包用单因素方差分析，方差齐者组间比较用LSD检验，方差不齐者用GamesHowell检验。     10-09-12 16:46:0

6、0     作者：李琳琳 卢衡 郑祥雄    编辑：studa202 结 果2.1 一般生化指标 雷帕霉素组及糖尿病组较对照组体重减轻，血糖、尿量明显增加(均P<0.01)，24hUalb、体重校正的Ccr也明显升高，表明DN建模成功。雷帕霉素组24hUalb、Ccr较糖尿病组显著降低(P<0.01，P<0.05)。雷帕霉素组与糖尿病组大鼠血糖、尿量比较差异不显著，见表1。2.2 肾组织病理检查结果 与对照组相比，糖尿病组肾重/体重显著增大，雷帕霉素组肾重/体重较糖尿病组减小，但还未降至对照组水平

7、。HE切片上，糖尿病组较对照组大鼠肾小球明显增大，伴球囊腔扩大。糖尿病组肾小球正切面积、肾小球体积较对照组明显增大(P<0.01)，雷帕霉素组此两项指标较糖尿病组显著降低(P<0.01)。见表2。PASM切片上，糖尿病组肾小球系膜区基质增生，系膜区扩大。MMEI较对照组增大，雷帕霉素组MMEI较糖尿病组降低(均P<0.01)，见图1。电镜检查：与对照组相比，糖尿病组毛细血管基底膜出现节段性增厚，足突大量融合，雷帕霉素组基底膜增厚较糖尿病组减轻，仍可见足突融合。见图2。2.3 CTGF在肾组织的定位和表达 免疫组化显示CTGF主要表达于肾小球上皮细胞，在球旁和肾小管区间质细胞及

8、管旁毛细血管内皮细胞也有微量表达。与对照组相比，糖尿病CTGF蛋白表达明显上调(P<0.01)，雷帕霉素组CTGF表达较糖尿病组下调(P<0.01)。见表3，图3。2.4 肾组织中CTGFmRNA的表达 如图所示，对照组大鼠肾皮质区CTGF低表达，与对照组比较，糖尿病组大鼠出现CTGFmRNA高表达(P<0.01)，雷帕霉素组CTGFmRNA的表达量显著低于糖尿病组(P<0.01)，但其表达仍然高于对照组(P<0.01)，见表3，图4。表1 各组大鼠生化指标变化与对照组比较：1)P<0.01;与糖尿病组比较：2)P<0.01,3)P<0.05，下

9、表同表2 各组大鼠肾小球平均面积、体积、MMEI的变化表3 各组大鼠肾小球CTGF平均光密度及mRNA比较3 讨 论本研究观察到，12 w末糖尿病组及雷帕霉素组大鼠均出现肾脏肥大，表现为肾重/体重明显增大，肾小球正切面积、体积较对照组显著增大(P<0.01)。由此，证实早期DN肾小球病理变化主要表现为肥大。可引起肾小球肥大的情况有多种，包括了肾小球固有细胞的增殖、肾小球固有细胞的体积增大及ECM的异常聚集。体外研究认为，糖尿病早期肾脏肥大常有短暂的细胞增殖，随后是较长时间的肾脏细胞的体积增大和代谢亢进4。近期的一些研究表明PI3K/AKT/mTOR通路的调控失常在糖尿病状态下肾脏肥大中发

10、挥了一定的作用。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)又称为蛋白激酶B(PKB)位于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的上游。营养及生长因子信号激活PI3K，进而导致AKT活化，AKT活化直接激活mTOR，mTOR通过磷酸化其下游的两个效应因子P70S6K及4EBP1，从而启动翻译过程，促进RNA和蛋白质的合成5。大量蛋白质物质在细胞内的堆积，造成蛋白质/DNA比例失调，导致细胞肥大。Nagai研究3高糖环境下系膜细胞肥大的机制，发现系膜细胞中AKT及mTOR是被激活的。雷帕霉素进入细胞后，与其胞浆受体FK506结合蛋白12相结合形成药物受体复合物，能与mTOR相互作用

11、，抑制P70S6K的活化和4EBP1的磷酸化，从而抑制RNA和蛋白质的合成。本研究表明，糖尿病大鼠经过8 w的雷帕霉素治疗后，肾脏肥大明显改善，大鼠24 h尿蛋白排泄量及内生肌酐清除率也较糖尿病组明显下调。因此，雷帕霉素抑制肾小球细胞肥大可能是其延缓DN进展的机制之一。CTGF是TGF1的下游调节因子,介导及增强了TGF1的促纤维化效应。体外实验显示,在高糖、机械张力,血管紧张素、晚期糖基化终产物(AGEs)和TGF1下,CTGF在肾脏细胞表达均明显增加。激活的CTGF进而促进(Col、Col、Col、FN)的合成6。本研究表明糖尿病组大鼠不仅24hUalb、Ccr显著升高，CTGF表达水平及

12、MMEI均较对照组也显著上调，证实CTGF在DN肾小球纤维化中的作用。Biecker7利用胆管切除诱导胆汁性肝硬变大鼠模型，雷帕霉素治疗28 d能有效减轻肝纤维化，减少肝脏TGF1、CTGF 及 PDGF的表达，其减轻肝纤维化程度与减少促纤维化因子表达水平相关。Lock的研究2发现，低剂量的雷帕霉素不仅抑制系膜细胞的增殖，还能抑制型胶原的分泌。Poulalhon等8利用人肺成纤维细胞研究雷帕霉素的抗纤维化作用。结果表明，雷帕霉素能够剂量、时间依赖性的减少型及型胶原的mRNA及蛋白水平。同时雷帕霉素还能显著的增加胶原酶MMP1的表达，证实雷帕霉素具有直接的抗纤维化效应。本研究发现，利用小剂量雷帕

13、霉素干预DN大鼠8 w，能显著下调CTGFmRNA及蛋白表达，减小MMEI，抑制系膜基质扩张。因此，抑制CTGF表达是雷帕霉素延缓DN的另一可能机制。在本研究中雷帕霉素对大鼠血糖没有明显影响，可见雷帕霉素并非通过对血糖的调控可来影响疾病的进程。【参考文献】  1 Chen JK，Chen J，Neilson EG,et al.Role of mammalian target of rapamycin signaling in compensatory renal growthJ.J Am Soc Nephrol，2005;16(5):138491.2 Lock HR，Sacks SH

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15、8(2):55261.4 Young BA，Johnson RJ，Alpers CE，et al.Cellular events in the evolution of experimental diabetic nephropathyJ.Kidney Int,1995;47(2):93544.5 Nissim Hay，Nahum Sonenberg.Upstream and downstream of mTORJ. Genes Dev,2004;18(16):192645.6 Twigg SM，Cooper ME.The time has come to target connective tissue growth factor in diabetic complicationsJ.Diabetologia，2004;47(6):9658.7 Biecker E，Gottardi AD，Neef M,et al.Longterm treatm