中性粒细胞在大鼠急性重症胰腺炎肺损伤中的作用机制(一)

1、中性粒细胞在大鼠急性重症胰腺炎肺损伤中的作用机制(一)    作者：徐军，刘学民，马清涌，潘承恩 【关键词】 急性病Experimental study on PMN in acute severe pancreatitis with lung injury【Abstract】 AIM: To study the apoptosis and necrosis of polymorphonuclear neutrophils (PMN) from bronchoalveolar lavage fluid in acute severe pancreatit

2、is (ASP) and to discuss the related mechanism. METHODS: Fortyeight male SD rats were divided into 2 groups (ASP group and control group). ASP model was established by injecting with 35 g/L taurocholic acid into the biliopancreatic duct. Both groups were sacrificed at 3, 6 and 12 h with 8 rats at eac

3、h time point. At scheduled time, bronchoalveolar lavage fluid was drawn and PMNs were then obtained by gradient density gradient centrifugation method. The ratio of apoptosis and necrosis of PMN was assayed by flow cytometry and LDH as well as index of lung permeability were measured. RESULTS: In AS

4、P group, the survival ratio of PMN increased and apoptosis of PMN was delayed. The level of LDH in bronchoalveolar lavage fluid and the index of lung permeability also increased. CONCLUSION: The delay of PMN apoptosis leads to persistent activation and leakage of toxic contents of PMN, which are clo

5、sely associated with lung injury【Keywords】 acute disease; pancreatitis; lung/injuries; neutrophils 【摘要】 目的： 探讨急性重症胰腺炎(ASP)合并急性肺损伤时肺泡灌洗液中性粒细胞(PMN)凋亡和坏死的发生规律及可能涉及的作用机制. 方法： 选取雄性SD大鼠48只，分为ASP实验组（24只）、对照组（24只）. 实验组大鼠穿刺胰胆管并注入35 g/L牛磺胆酸钠制作ASP大鼠模型，分别在制模后3, 6, 12 h剖杀，于预定时相取支气管灌洗液，密度梯度离心分离，用流式细胞仪测定PMN凋亡、坏死比例

6、，同时测定乳酸脱氢酶()含量、肺通透指数. 结果： ASP组大鼠肺灌洗液中存活细胞比例增加（P0.01），凋亡延迟. 同时，肺灌洗液明显升高（P0.01），肺通透指数显著增加（P0.01）. 结论： ASP合并急性肺损伤时,PMN凋亡延迟，造成持续处于激活状态及毒性内容物的持续释放，与急性肺损伤密切相关.【关键词】急性病；胰腺炎；肺/损伤；中性白细胞0引言急性重症胰腺炎(ASP)时大量中性粒细胞(PMN)聚集、扣押于肺组织中，并在其后发生的急性肺损伤(ALI)中起重要作用. PMN是急性呼吸窘迫综合征（ARDS）发生、发展的关键细胞1，其在肺内如何消散在一定程度上决定着ARDS的转归. 目前，

7、对于ASP并发ALI 时扣押于肺组织中的PMN的作用及其转归，以及与肺损伤发生发展的关系等问题研究尚少. 我们通过制备大鼠ASP合并ALI模型，动态观察肺灌洗液中PMN凋亡的发生规律，以揭示PMN在ALI中的作用.1材料和方法1.1材料雄性SD大鼠48只（西安交通大学动物实验中心），体质量260300 g, Percoll分离液为Pharmacia公司产品，AnnexinvFITC 凋亡检测试剂盒(AnnexinvFITC Apoptosis Detection Kit)系Sigma 公司产品. 采用Hitachi7170全自动生化分析仪，美国BD公司流式细胞仪FACS.calibur，Hit

8、achi600型透射电镜.1.2方法统计学分析： 数据以x±s表示，2组各项参数均采用方差分析进行比较. P0.05表示差异有统计学意义.2结果2.1LDH含量对照组大鼠肺灌洗液中可检测到少量的LDH,但较血中明显减少. 实验组各时段肺灌洗液中LDH显著增加,与对照组有显著性差异(P0.01)，但各时间点的LDH差异不明显. 对照组大鼠血中可检测到少量的LDH，实验组各时段血中LDH显著增加, 与对照组有显著性差异(P0.01),但各时间点间无明显差异(Tab 1). 表1ASP各时段MPO活性及血清LDH活性（略）2.2肺通透指数和PMN凋亡实验组各时段肺通透指数均明显升高，与对照

9、组比较有显著性差异（Tab 2）. 对照组大鼠肺泡灌洗液中PMN的凋亡处于相对较高水平，各时间段无显著差异. 实验组大鼠肺泡灌洗液中PMN的凋亡明显减少，与对照组存在显著差异(P0.01, Tab 2). 表2肺泡灌洗液中PMN凋亡比率、LDH活性及肺通透指数（略）2.3肺组织MPO活性实验组各时段与对照组相比，肺MPO活性均明显升高，且各时段内相互比较，肺MPO活性随时间呈增加的趋势，在12 h段达到峰值(P0.01, Tab 1). 2.4肺组织病理改变对照组肺组织结构清晰，肺泡壁薄，肺泡腔内偶见巨噬细胞，未见PMN浸润. 实验组可见较多的肺泡萎陷及邻近肺泡隔断裂形成肺大泡，毛细血管扩张、

10、充血，肺间质水肿，灶状肺泡内出血，肺组织大量PMN浸润,上述改变随时间推移逐渐加重. 电镜下可见对照组毛细血管基模完整，腔内血浆电子密度均匀，内皮细胞胞质紧密连接. 肺泡I型上皮细胞胞质连续，肺泡II型上皮细胞胞质有散在不规则空泡，线粒体结构清晰. 实验组可见部分肺泡萎陷间质水肿，毛细血管腔内可见PMN和红细胞聚集，内皮细胞肿胀，胞质连接间隙增宽，并有大量空泡形成，线粒体空化，内质网扩张，胞质不连续，有窗孔形成，细胞连接间隙增宽，血管基底膜肿胀，肺泡腔内可见絮状渗出物. 上述病变随时间推移渐重.3讨论PMN作为机体防御系统的重要组成部分，其凋亡的研究日渐受到重视. ASP继发ALI时,肺内过度

11、性、失控性炎症反应是导致ALI的根本原因. PMN是造成其过度性炎症反应的元凶 ，其介导的组织损害效应在全身炎症反应综合征（SIRS）和多脏器功能衰竭（MODS）发病中占据核心地位2. 浸润PMN凋亡后被巨噬细胞清除使炎症消退是避免组织损伤加重的重要机制3. 如肺组织内PMN功能寿命延长,被过度激活后引起组织损伤,并最终导致ALI的发生4. 我们的结果证实肺内聚集的PMN出现延迟凋亡, 导致其功能寿命延长. 生理条件下循环血中主要以凋亡的形式被清除. 普通炎症时，通过快速凋亡清除炎症局部的是限制组织损伤、促进炎症消退的主要机制5. 而在我们的研究中，ASP所致的肺内PMN凋亡延迟可能是时炎症失

12、控的重要机制. 肺内浸润的PMN能释放出各种氧化剂(如超氧阴离子、22、氧自由基、 )、各种蛋白酶如弹性蛋白酶和磷脂酶2等. 直接水解肺泡表面活性物质及肺泡内磷脂成份,从而引起肺不张及肺实质损伤6. 因此，凋亡延迟是导致ALI发生的重要因素7. 我们的实验证实，ASP大鼠肺灌洗液及血浆中含量均明显升高. 血浆含量升高反映肝脏和肺脏(特别是肝脏)损伤5，而肺灌洗液含量升高则反映了肺组织的损伤. 结合病理检查所观察到的肺组织损伤，说明实验组大鼠确已发生. 肺通透指数的升高表明微血管通透性增强，肺MPO活性的增加进一步提示PMN向肺组织间隙的大量聚集. 总之,在ASP继发ALI时，PMN介导的组织损

13、害效应在发病中占据核心地位. 【参考文献】1 Gukovskaya AS, Vaquero E, Zaninovic V, et al. Neutrophils and NADPH oxidase mediate intrapancreatic trypsin activation in murine experimental acute pancreatitis J. Gastroenterology， 2002;122:974-984.2 王鹏,海春旭,梁欣,等. 小鼠PMN的耗竭对光气所致急性肺损伤的影响J. 第四军医大学学报,2004;25(8):741-743.Wang P, Hai

14、 CX, Liang X, et al. Effect of PMN depletipn on mouse acute lung injery induced by phosgeneJ. J Fourth Mili Med Univ, 2004;25(8):741-743.3 Hartwig W, Carter EA, Jimenez RE, et al. Neutrophil metabolic activity but not neutrophil sequestration reflects the development of pancreatitisassociated lung i

15、njury J. Crit Care Med, 2002;30(9):2075-2082.4 张刚,修瑞玲,杨训,等. 肿瘤坏死因子基因表达、细胞凋亡与急性胰腺炎肺损伤关系的实验研究J. 中华消化杂志,2002;22(1):22-25.Zhang G,Xiou RL,Yang X, et al. A stude on intrapulmonary expression of tumor necrosis factor agenead cell apoptosis in rats with acute pancreatitis J. Chin J Digest, 2002;22(1):22-25

16、.5 刘韧,肖南,田昆仑,等. 中性粒细胞凋亡延迟在脂多糖所致大鼠急性ALI发病机制中的作用 J.中华医学杂志,2001;81(10):617-621. Liu R, Xian N, Tian KL, et al. The role of PMN apotosis delay in acute lung injury induced by administrating LPS J. National Med J China, 2001;81(10):617-621.6 陈熹,姚恒,纪宗正,等. 磷脂酶A2对急性胰腺炎大鼠肺损伤的作用J. 第四军医大学学报,2003;24(11):988-989.Chen X, Yao H, Ji ZZ, et al. Effects of phospholipase A2 on lung injury in rat acute necrotizing pancreastitisJ. J Fo