RNA聚合酶II启动子shRNA表达载体构建的研究进展

1、位嵋字杂志,2010,20(2:47-,48,502010CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATIONRNA聚合酶II启动子shRNA表达 载体构建的研究进展周天龙1王会敏2综述 周青霞1审校中周分类号R34文献标识码A 文章编号10051740(201002一0047一03置蚕虢瑟蔫主戮翳1RNA聚合酶II启动子调控的RNAi中的效应分子及作 用机制有两类RNA分子参与RNAi:小干扰RNAs(siRNAs 和miRNAs。前者主要由RNA聚合酶III启动子启动表达, 而后者为聚合酶11启动子表达调控。miRNA是一类长约22个碱基的非编码RNAs,它们与 信使RN

2、A结合并调控其翻译或将其降解口。对模式生物 秀丽新小杆线虫、果蝇的研究结果显示,生物体内天然存在 miRNA基因,在细胞核内转录生成含有几百个或几千个核 苷酸的原始miRNA(Primary miRNA,pri-miRNA。由 RNAse家族的Drosha切割生成miRNA前体(Precursor miRNAs,pre-miRNAs,pre-miRNAs长70nt,3端有2个核苷酸的突出。随后,其在Exportin5的协同作用下进入 细胞质,并被Dicer转变为成熟的miRNA。接着,miRNA与 RNAi诱导沉默复合物(RNAi-lnduced Silencing Complex, RISC

3、中的Argonaule-2(其能选择性地组装那些5末端结作者单位,咸宁学院附属第二医院检验科,邮政编码 成宁 437100;2广东省中医院二沙岛分院检验科本文2010-01-20收到.20100312修回,20100324接受砸字杂舂2010年荒20卷第2舶 构疏松的RNA链结合,一旦进行到这一步骤,RISC即会 发挥下调同源mRNAs表达的作用。当miRNA与mRNA 完全同源时,其能降解mRNA,而当其与mRNA不完全同 源时,其会在翻译水平下调基因的表达口J。在人类,迄今已 经发现了大约470种miRNA,并且还在哺乳动物中对其进 行了许多研究56。研究认为每种miRNAs能调控数百种

4、信使RNA,但miRNA的靶基因仍没有被鉴别出来7。2miRNA与s诹NA的相似点及不同点miRNA与RNAi经典途径中的siRNA存在一些相似 点及不同点阳.9.相似点:(1siRNA和miRNA都由Dicer 产生;(2两者都由22个核苷酸组成;(3两者都能与一些核 酸酶一起形成RISC。不同点:(1siRNA通常来源于动物 RNAi中或是植物转录后基因沉默中的长双链RNA(Long Double-Stranded RNA,dsRNA,而miRNA则是内源性的; (2siRNA被Dicer处理后形成3末端悬挂两个核苷酸的双 链结构,而miRNA在通常情况下是单链结构1们(3siRNA 被组

5、装为RISC后能降解靶mRNA,而miRNA常常不降解 靶mRNA,而是在翻译水平下调相应基因的表达11”3;(4 细胞内主要结构性的含22个核苷酸的RNA是miRNA,而 siRNA通常在病毒感染或dsRNA被人工引入细胞内及转 座子被激活后被诱导产生,因此siRNA主要在抑制转座子 的活动和病毒感染中发挥作用。3RNA Pol 111启动子驱动的shRNA表达载体的缺点经化学合成的siRNA被转染到细胞内,能发挥沉默基 因的作用,但因其量少,只能在细胞内发挥短暂的效应,且由 于其合成成本高,在一定程度上限制了其应用。而shRNA 在结构上与内源性miRNA前体相似,其进入细胞后被Dicer

6、 处理为21个核苷酸的siRNA或miRNA而发挥RN加效应。 尽管shRNA载体作为一种工具已被广泛用来分析基 因的功能,但现有的shRNA载体却存在一些缺陷。如每个 shRNA只能表达一个shRNA,所以,抑制多个基因就需要 有多个启动子或载体,甚至在相同载体转染时。多个shRNA 也不能达到相似的共表达水平。另外,对引入的shRNA的综迹 周天龙.王会敏检测需共表达一个由RNA Pol II启动子驱动的报告基因, 这种情况下,标记基因的表达并不总是与shRNA的表达相 一致。还有,调控RNA Pol III启动子的表达比调控RNA Pol II启动予的表达更为困难。而含RNA Pol I

7、I启动子的 RNAi表达载体能够克服RNA Pol III启动子的缺陷1“。 4含RNA Pol II启动子的shRNA表达载体的构建及应用 4.1利用miRNA前体的干袢环结构作为合成miRNA的 骨架Lo等”3用siRNA序列代替miR一30干袢环结构的主干 部分设计合成了能在RNA Pol II启动子控制下表达的 miRNA,用此miRNA能够有效地抑制人类免疫缺陷病毒一1 (HIV-1的复制,抑制效率直接与其表达水平相关。他们还 发现载体的拷贝数与启动子的长度均能影响siRNA抑制 HIV-1复制的能力。而且,他们联合应用RNA Pol II和RNA Pol III启动子分别表达两种不

8、同的siRNAs,结果显示其增强 了抑制HIV-I复制的效能而且没有影响到细胞的活力。 Zhou等”3用巨细胞病毒(CMV启动子检测了一系列 模拟人类miRNAmir-30结构的发夹结构的变异体,结果 发现采用真正人类miv30结构的发夹在沉默基因方面最有 效。另外,他们又将最有效的发夹置于另一个人类RNA Pol II启动子一UbC的下游,然后将这个重组体与广泛使用的 RNA Pol III启动子驱动的发夹重组体进行比较,结果, RNA Pol II启动子与RNA Pol III启动子相比,前者能驱动 shRNA的合成并能高效介导基因沉默。4.2直接将shRNA置于RNA Pol II启动子

9、的下游Ling等18将针对Survivin设计的shRNA插入到pEG一 蕾膏亨赫2010年第20卷薏2期 FPcl载体(含RNA Pol II启动子GFP cDNA的3末端的 下游,然后用构建好的载体转染HeLa细胞,结果发现RNA Pol II启动子转录出的与GFP以融合形式结合的shRNA抑 制了荧光素酶的活性及Survivin的表达,这表明shRNA袢 环结构外多余的RNA序列(GFP并没有影响shRNA的功 能。该作者第一次证实shRNA能在其非翻译区以融合表 达的形式发挥作用。Lakka等1叼等针对uPAR序列合成了21个碱基对+5个碱基的袢环+BamH I位点的核苷酸,在6x S

10、SC缓冲液内 退火后连接到pcDNA3载体(含CMV启动子的BarnH I位 点,相似地,金属白酶一9(MMP-9序列的22个碱基+5个碱 基的袢环+EcoR I位点的核苷酸被连接到上述载体的EcoR l位点,最终构建了同时表达uPAR和MMP一9siRNA的双 基因表达载体,这个重组体同时抑制了两个基因的表达,且 在体内外实验中抑制了血管样结构的形成,最终显著抑制了 神经胶质瘤细胞的侵袭及肿瘤的生长。.5展望近年来,RNAi技术取得了迅猛发展,已被广泛用于探 索基因功能和多种疾病及恶性肿瘤的基因治疗。但是有很 多因素会影响RNAi的效率,如在抗病毒治疗时,一些RNA 病毒和DNA病毒会产生突

11、变从而逃避RNAi;某些靶mR NA的结构也会影响沉默效率;由于哺乳动物体内缺乏内源 性RNA扩增机制,外源性RNAi作用会随着时间而逐渐减 弱等等。所以,用同时沉默两个或两个以上基因的RNAi技 术能极大地提高RNAi的效率,从而为疾病的治疗提供更为 有利的工具。但是传统的采用RAN Pol Ill启动子方式存 在着许多缺点,且同时沉默多个基因有一定困难,采用RAN Pol II启动子能弥补其缺陷,并能同时转录出多个shRNAs, 从而为多基因沉默开辟了道路。Lo等15联合应用RAN Pol II和RAN Pol III启动子达 到了沉默两个HIV-1片段进而增强了抑制病毒复制能力的 目的;

12、Chung等173等利用SIBR载体在一个转录本上同时 表达两个不同的miRNAs。且这两个miRNAs均能有效抑制 两种不同的靶MRNA;Silva等203用日益增长的RNAi生物化 学理论构建了第二代shRNA表达库,这些构建体模拟了天然 的miRNA前体,因内源性的miRNA允许在组织特异的且可 被诱导的启动子的控制下构建重组体,故大规模第二代短发 夹载体库得以构建,而且在RNA Pol II启动子控制下构建的 表达载体能有效抑制培养细胞和动物体内基因的表达。综上所述,用RAN Pol II启动子代替RAN Pol III启动 子进行RNAi,不仅能达到与RAN Pol III启动子相同

13、的,而 目且并且还能克服其缺点,同时沉默多个基因,从而为疾病 治疗提供了更为有效的方法。 本文第一作者简介:(下转第50页 综迹50吴国荣,陈国千,王春新.等 参考文献1Le Bricon T,Thervet E,Froissart M,et a1.Plasma cystatin C is superior to24h creatinine clearance and plasma creatinine for esti-mation of glomerular filtration rate 3months after kidney trans plantation.Clin Chem,20

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