酶解法提取山楂黄酮的工艺

1、酶解法提取山楂黄酮的工艺56罢88食品研究与开发第31卷第期民明町司'1r及基础研究酶解法提取山楂黄酮的工艺刘晓光.毛波.胡立新:?'(1.内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,北京101107;2.湖北工业大学膜技术研究所,湖北武汉430068)摘要:重点研究以纤维素酶酶解提取山楂果黄酮的工艺.考察纤维素酶的浓度,pH值,温度,时间,料液比5个单因素.结果表明其最佳条件为:酶质量浓度为0.15mg/mL,酶解pH值为5.0,酶解温度为55oC,酶解时间为90min,料液比为l:12(g:g).而在这个最佳条件下,黄酮的提取率可达到90%,且黄酮类化合物的活性依然存在.关键词:山

2、楂果;总黄酮;纤维素酶StudyonExtractionofFlavoneinHawthornwithEnzymeLIUXiao-guang,MAOBo,HULixin2,(1.InnerMongoliaMengniuDairy(Group)Co.,Ltd,Beijing101107,China;2.HubeiUniversityofTechnologySchoolofChemicalandEnvironmentalEngineering,Wuhan430068,Hubei,China)Abstract:Thisexperimentkeypointresearchthetechnologywi

3、thenzymatichydrolysisofcelluloseenzymeextracttheflavonoidsfromhawthorn.Examinedtheconcentrationofcellulase,pH,temperature,time,solidliquidratiooffivesingle-factors.Theresultsshowthattheoptimumconditionsis:massconcentrationofenzymeis0.15mg/mL,pHis5.0,temperatureis55,timeis90min,solid-liquidratiois1:1

4、2(g:g).Inthisoptimumconditions,notonlytheeflavonoidsextractionratecanreach90%butalsoensuretheactivityofflavonoidscompoundstillexist.Keywords:hawthorn;totalflavone;cellulase山楂属于蔷薇科植物,在我国具有悠久的保健与药用历史.山楂果中含有丰富的营养成分:黄酮类化合物,山楂酸,熊果酸,果胶,维生素,有机酸,糖类以及氨基酸等30多种重要化合物1】.其中黄酮类化合物占有7%左右,其功能能改善血液循环,降低胆固醇,改善心脑血管,降低血

5、糖和三元脂肪酸丙酯和稳定胶原质等,同时它还是一种很强的抗氧化剂囝.山楂黄酮的提取方法国内外许多学者都做了大量研究,大多数只限于山楂叶的研究,但是其含量较低,提取效率受到限制3.再加上大多数只限于醇提,而溶剂在回收时会增加试验的复杂性和能耗,以及在最终的提取产品中还有可能含有这些有机溶剂.山楂黄酮是包裹在细胞壁中,而这些细胞壁的主要成分是纤维素.为了提高提取率就必须先打破细胞壁释放出里面的物质.所以纤维素就成了影响提取率的最大因作者简介:刘晓光(198l一),男(汉),工程硕士,研究方向:食品加工工艺.通信作者:胡立新(1966一),男(汉),副教授,副院长.素【4J.为了避免有机溶剂的残留以及

6、提高提取率,本试验将应用纤维素酶对山楂黄酮进行提取分析.1材料与分析方法1.1材料与试剂山楂粉:河北省黄骅市天福园绿色健康产业有限公司;芦丁标样:北京维欣仪奥科技发展有限公司;膜设备:广州洁圣膜技术有限公司;纤维素酶:张家港市金源生物化工有限公司;乙醇,盐酸.1.2试验仪器722N可见分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;pH计:菏泽市鑫源仪器仪表有限公司;电导率仪:上海宇隆仪器有限公司;恒温水浴锅,搅拌机.l_3含量检测51工作曲线的绘制:按照文献所述4】的方法得到计算芦丁含量y(1g/mL)与吸光度A间的回归方程为:y=558.258A+1.63834,相关系数r=0.9996.山楂果黄酮

7、的计算旧:参考资料所应用的方法,即基础研究食品研究与开发2010年8月第31卷第8期取水提后的待测液5.0mL于50mL容量瓶中,用30%乙醇定容,取2.0mL于10mL容量瓶中,以下操作同上面的标准曲线一样,测定其在510nm处吸光度A.从山楂果中提取的总黄酮含量可按下列公式计算:Jy×××10×1o总黄酮含量=一xl00%W式中:100/5,51Y2为稀释倍数;为山楂粉末的重量.1.4有效性检测通过文献所述,运用化学试剂显色反应来鉴定酶解提取的黄酮类化合物的活性是否失活,其主要是选取一些比较有代表性的试剂进行显色反应.并通过化学试剂的显色反应结果来判

8、断黄酮类化合物的活性.2试验方法加酶提取按如下试验方案进行:山楂粉一酶解一离心一上清液/沉淀物一水提一上清液一混合液一待测其中沉淀物的水提条件:料液比1:15,温度5O和搅拌时间1h2.1酶解最佳条件的确定为了更精确的研究出最佳条件:称取6.0g山楂粉,分别选取了5个单因素25个值进行试验.即酶质量浓度:0.05,0.1,0.15020.25mg/mL;pH值:3.5,4,4.5,5,5.5;酶解温度:40,45,50,55,60cI=;酶解时间:30,60,90,120,150min;料液比:1:5,1:8,1:10,1:12,1:15.在单因素试验结果的基础上,确定每个单因素的最佳值所处的

9、范围,并根据这个范围取相应的值进行正交试验来确定酶解的最佳工艺条件.2.2活性测定在上面确定的最佳条件下,对山楂进行酶解,离心,再把沉淀物水提1次,混合2次提取液.然后用膜对提取的综合液进行浓缩.然后根据1.4的方法对浓缩液进行化学试剂显色反应来鉴定提取物的活性.3结果与分析3.1用酶解提取黄铜的条件选择?单因素试验将山楂粉用纤维素酶解后,进行总黄酮的提取与分析,与直接用水提取山楂总黄酮的提取与分析,其结果见下表1.由表1可见,在pH值4.5,温度50,时间1h,料液比1:10的条件下浸提.加酶效果显着.3.1.1酶浓度对浸提效果的影响在pH值4.5,温度50,时间1h,料液比1:10的S=I

10、裹1酶解对提取黄酮的影响Table1Theeffectsofenzymeonextractionofflavone条件下,浓度对黄酮提取的影响,见图1.咖m蕊=II砥趱酶质量浓度/(mg/mL)图1酶的质量浓度对总黄酮含量的影响Fig.1Effectoftheenzymemassconcentrationonthecontentofthetotalflavonoid由图1可以看出,随着酶质量浓度的提高,总黄酮含量也在不断地匕升,当酶的质量浓度达到0.15mg/mL的时候,总黄酮含量的增加就会变得缓慢一些,由此可知总黄酮的提取也差不多达到最值了.而且,当总黄酮含量达到最值时,它是不会随着酶量的增

11、加而有所变化.而酶解过度又可能对黄酮的苷键造成影响.因此,结合实际隋况,认为酶的最佳质量浓度在0.15mlL左右.3.1.2温度对酶解效果的影响温度对酶解效果的影响的试验条件:纤维素酶的浓度0.1mg/mL,pH值4.5,时间1h,料液比1:10,结果见图2.面托匿粗氆酶解温度,图2温度对总黄酮含量的影响Fig.2Effectofthetemperatureonthecontentofthetotalflavonoids由图2可知:温度越高,酶解效果越好.但温度过高,一方面会破坏黄酮类化合物的活性,而溶出的杂质也在增加,另一方面也会增加试验的复杂性和能耗.因此,根据实际情况,选择的最佳温度在5

12、5左右.3.1.3pH和酶解时间对黄酮提取的影响pH对酶解来说是很重要的一个因素,最佳的pH-=t5蔷塞鋈3'1食品研究与开发第卷第8期艮丽研司,t及基础研究pH图3pH值对总黄酮含量的影响Fig.3EffectofthepHvalueonthecontentofthetotalflavonoids能发挥出酶的最佳功能.因此在其他相同的条件下,pH对总黄酮含量的影响从图3可以看出,总黄酮的含量随着pH的变大而增加,直到达到pH=5.0时,总黄酮含量的增加有些平缓了,而随着pH值得不断增大,溶出的杂质也越来越多.因此,综合考虑本试验取pH=5.0左右为最佳pH值范围.嵩警驽酶解时j司ra

13、in图4酶解时间对总黄酮含量的影响Fig.4Effectofthereactingtimeonthecontentofthetotalflavonoids由图4可以得知,随着酶解时间的延长,其提取的总黄酮也在不断地增加,当到达120min的时候,总黄酮的增加量就变得小多了.但是直到达到一定时间后,总黄酮的含量是会趋向一个平衡值.因此,从各方面考虑,选择的最佳时间为t=12Omin左右.3.1.4料液比对黄酮提取的影响料液比对于下一步的试验很重要,如果料液比过小,就会导致有些物料没有被浸泡,在试验时它们就有可能没有被酶解到,最终会导致总黄酮含量偏低,而料液比太大,不仅浪费水资源,也不利于试验的进

14、行.因此恰当的料液比很重要.从图5中可以看出最佳料液比在1:12左右.3.2正交试验的设计3.2.1试验设计,根据以上单因素的试验所确定的范围,以山楂果总黄酮含量为考察指标设计正交试验来确定最优方案,即采用I_9(3s)的正交表来安排试验.3.2.2数据处理由表3可以看出,正交试验所考察因素的总体趋65.5咖l托5骧4.s,43.51:81:101:121:l51:20料液比图5料液比对总黄酮含量的影响Fig.5Effectoftheratioofsolidtoliquidonthecontentofthetotalflavonoids表2因素水平设计Table2Levelsofexperim

15、entfactors.一因素.'A浓度/(mg/mL)B温度,cpHDUN/minE料液t/(g:g)势与单因素时的趋势基本一致,每个因素的对酶解的提取效果的影响的大小为:pH>酶浓度>酶解温度>料液比>酶解时间.因此,从正交表中可以得出最佳提取工艺为A,B2CD.E:.但是,从实际的角度来看,酶的浓度越大,酶解出来的总黄酮也会越多,带出来的杂质也越多,后面的处理也越难,也不太经济,而其浓度达到一定值后,它会处于一个水平状态.因此,选择ABC2DE为最佳方案,即酶质量浓度0.15mg/mL,酶解pH值5.0,酶解温度55,酶解时间

16、90min,料液比1:12M拍565665666.:.渤肌.2.一一436;3,.:599337624986962&&DJ9JBll16650卯,&&JA.4K基础研究食品研究与开发2010年8月第31卷第8期4效果表征显色结果如下表4所示.表4酶解提取物显色试验结果Table4Theresultsofenzymaticbydrolisextractioncolortest从中可以看出提取的黄酮与FeC1,溶液反应显墨绿色,与镁盐反应在紫外光下显天蓝色荧光,与铝盐试剂反应明显地表现出黄酮类化的性质,因此可以得出结论:经过酶解后,山

17、楂中黄酮类化合物的活性依然存在.5结论采用酶解法提取山楂总黄酮,经过正交试验得出最佳提取工艺条件为:酶质量浓度0.15mg/mL,酶解pH值5.0,酶解温度55,酶解时间90rain,料液比1:12.试验证明,使用酶解法可以使果肉中的黄酮类物(上接第39页)表3统计优选方法预测提取率大于5.8%的频数分布Ilable3Frequencydistributionoftheextractionrategreaterthan5.8%项目水平频数一210l,加权平均值标准误95%置信区间相应试验措施乙醇用量,倍液固比,(m)时间/II温度00O5001512916l9l8l0l5190.6739I.0

18、6521.21740.13920.II380.1lI70.393伽.95430.8360-1.29440.9921.44243.4-4.038.3m_43.0mL/g3.4h3.9h0O0163O1.65220.07lI.5092I.795295.1一97.5发现乙醇用量为3.4倍4.0倍,液固比为38.3:143.0:1(mL),提取时间为3.4h3.9h和温度在95.1-975oC时,多糖提取率有95%的可能性高于5.8%.3结论I)通过二次回归正交旋转组合建立回归的方程,排列出了四因素之间主次关系的顺序,依次为温度>液固比>乙醇用量>时间.2)在

19、试验范围内,温度和时间的交互效应以及温度和液固比的交互效应均达到极显着(P(0.0001).因此,高温,短时,低液固比的组合,或者低温,长时,高液固比的组合,都能够达到同等水平的多糖提取率.59=I质充分地释放出来,其提取率与未经酶解的相比较,酶解法可较显着提高山楂黄酮的提取收率,且提取出的黄酮的活性依然存在.参考文献:.fl】刘荣华,邵峰,邓雅琼,等.山楂化学成分研究进展【J.中药材,2008,5(7):732刘武.山楂的营养化学成分及保健作用明.食品研究与开发,2002,23(5):65-66313刘北林,董继生,霍红.山楂黄酮最佳提取工艺探讨【J.食品科学,2007,8(6):167f4张黎明,张小利.酶解一吸附澄清法提取山楂叶总黄酮的工艺研究J.化学工程,2007,13(8):85-875徐礼焱.中草药有效性成分分析法(下册)M.北京:人民卫生出版社,1984:69716】何改.山楂叶黄酮类化合物最佳提取工艺研究J】.食品研究与开发,2002,23(1):1517【7林启寿.中草药成分化学【M】.北京:科学出版社,1997:305收稿日期:20091221l¨IH】¨3)金顶侧耳多糖得率的最优条件适用范围为乙醇用量为3.4倍一4.0倍,液固比为38.3:143.0:1(mlJg),提取