《发酵工程》第3章培养基的制备与灭菌

1、第三章培养基的制备教学内容（4学时）：了解培养基的营养成分，掌握培养基的类型和用途了解发酵培养基的选择，了解原料转换的意义O了解淀粉水解糖的制备方法O了解生物合成的前体物质及促进剂第一节培养基的原材料 培养基的营养成分 培养基的类型 发酵培养基的选择 原料转换及意义一、培养基的营养成分及用途碳酸气淀粉水解糖、糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等石油、正构石蜡、天然气醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础;'有机氮：黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、蛋白脓、酵母粉、鱼粉、发酵菌丝体、酒糟水等无机氮：尿素、硫酸锈、氨水、硝酸盐功能：构成菌体、含氮代谢物；磷酸盐、钾盐、钙盐

2、等矿物盐3.无机盐铁、猛、钻等微量元素功能：构成菌体，参与酶的组成，维持酶活性,调节渗透压，调节pH值，维持氧化还原电位;4.特殊生长因子：硫胺素、生物素、对氨基苯甲功能：酶的辅助部分，维持生命活动;5.发酵的促进剂与抑制剂发酵培养基中某些成分的加入有利于调节产物的形成，而并不促进微生物的生长，这些物质包括前体、促进剂和抑制剂1）、前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构没有多大的变化，但产物的产量却因加入前体而有较大的提高。如：在青霉素生产中加入玉米浆，青霉素产量可从20u/mL增加到100u/mL,研究发现玉米浆中的苯乙胺被有限

3、结合到育霉素分子中，从而提高了青霉素G的产量。半胱氨酸侧链母核6APA 3）、抑制剂：在发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另外一些代谢途径活跃,从而获得人们所需要的某种产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。 例如：微生物发酵生产甘油中，例如亚硫酸氢钠，它与代谢过程中的乙醛生成加成物。 6.水分功能：生化反应均在水溶液中进行二、培养基的类型 1.依营养物质的来源分类 天然培养基； 合成培养基，也称组合培养基（多用于定量研究）： 半合成培养基，（用的最多，在部分天然有机碳源、氮源、生长因子的基础上，适当加入一些化学药品）； 2.依培养基的物理状态来分： 1）固体培养基 A、

4、凝固培养基：即遇热可融化，冷却后则凝固的固体培养基 B、非可逆性凝固培养基：指有血清凝固成的固体培养基或由无机硅胶配成的凝固后即不能再融化的固体培养基 C、天然固体培养基：由天然固体状基质直接制成的培养基，如数皮，米糠，木屑等 D、滤膜：是一一种坚韧且带有无数微孔的醋酸纤维湖膜，把它制成圆片状覆盖在营养琼脂或浸有培养液的纤维衬垫上，形成了具有固体培养基性质的培养条件。2）半固体培养基再配置号的液体培养基中加入0.5%左右的琼脂作为凝固剂，形成的培养基称之微半固体培养基。主要用于菌种鉴定，观察细菌运动特征及噬菌体的效价测定等3）液体培养基；培养基中8090%是水。 3.依培养基的用途来分 1）、

5、池子培养基 2）、种子培养基 3）、发醉培养基 4）、补料培养基 5）、加富培养基 6）、选择培养基 7）、鉴别培养基 8）、增殖和保存培养基 9）、富集培养基 10）、测定培养基三、发酵培养基的选择 一）、配置培养基的原则 1、根据不同微生物的营养需要配置不同的培养基 2、注意各营养物质的浓度和配匕 3、调节适宜的物理化学条件 4、根据培养微生物的FI的配置 5、尽量使用廉价易得的原料二）、配置培养基的方法 1、生态模拟 2、查阅文献 3、借助优选法或正交试验法精心设计培养基配方 4、实验比较实验的规模-般由定性到定量，由小到大。发酵培养基的用途与要求、成分、配比经实验确定，配制时兼顾原料来

6、源、成本及工艺管理；发酵培养基的选择程序门要了解生产菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求；»对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品质量要求等要有所了解3应先以合成培养基为基础，先进行推瓶试验，再进行小型发醉罐培养，探索此生产菌种对各种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力要注意培养过程中的pH值变化，比较适于菌体生长繁殖和适合于代谢产物形成的pH值差异，不断调整在初步研究的基础之上，先确立一个培养基配比；再进行各种重要的金属和非金属离子的影响试验，试验各种无机盐的最高、最低和最合的用量在合成培养基的基础上，进

7、行复合培养基试验，探讨各种发酵条件和培养基的关系。如培养过程中的pH值变化与培养法各种组成的关系。I、原料转换及意义1、节约原料，减低单耗，提高发酵单位和总收率；2、开拓新的原料资源和微生物资源：野生植物淀粉、植物纤维、木屑水解物、石蜡、醋酸、乙醇日本1959年开始研究由醋酸发酵生成谷氨酸的工艺，并于1968年由味之索公司设厂制造，为发酵法制造谷氨酸由“粮食发酵”转入“无粮发酵”奠定了基础。谷氨酸发酵原料：最初用葡萄糖，以后改用淀粉水解糖液或普粉水解糖液，产糖地区则采用价格低廉的糖蜜为原料随着石油化工的发展，合成醋酸和乙醇的产量逐年增加，醋酸和乙醇作为一种新型发酵原料,越来越受到重视。近年来，

8、国外乙醛代粮发酵的研究取得了重大进展，除抗生素外，几乎所有用粮食发酵生产的产品，如氨基酸、有机酸、酶制剂、单细胞蛋白、糖类、脂肪、维生素、核酸类物质等，都可以用乙醇为碳源发酵生产。第二节淀粉水解糖的制备 一、淀粉水解糖的制备方法 1、酸解法： 定义：以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法. 优点：设备要求简单，水解时间短（20min）,设备生产能力大 缺点：高温高压下进行，设备要求耐腐蚀、耐高温、耐高压，副反应多，对原料要求严格，淀粉颗粒不宜过大，淀粉乳浓度不能过高。 2、酶解法：（双酶水解法） 定义：用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。一般分为两步：第一步是利用a

9、淀粉酶将淀粉液化转为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化。第二步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，称为糖化。也称双酶法a淀粉随（液化）葡萄糖淀粉酶（糖化）优点：1、反应条件温和。2、酶的专一性强，副反应少3、可在较高的淀粉乳浓度下水解4、糖液的营养物质丰富5、糖液色泽浅，无苦味，有利于糖液的精制缺点：时间长（2-3）天，要求的设备多，糖液过滤困难。酶结合法酸醯法酣酸法1）酸酶法 事先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酣将其水解为葡萄糖 玉米、小麦等谷类淀粉，淀粉颗粒坚实，如用。一淀粉酶在短时间内液化往往不彻底。 酸液化速度快，且糖化是由酶来进行的，对

10、液化液要求不高，可采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率。用酸量较少，产品颜色浅，糖液质量高。2）酶酸法 先用Q淀粉酶液化到一定程度，然后用酸水解成葡萄糖 有些原料（如碎米淀粉），颗粒大小不一，酸法水解不均匀，出糖率低，故采用先经淀粉酶液化，过滤除杂质后再酸水解 能采用粗原料淀粉，淀粉浓度较酸法高，生产较易控制，时间短。而且酸水解pH稍高，可减少副产物的形成，糖液色泽较浅。表2-2不同糖化工艺糖化质量比较二、淀粉酸水解理论基础 淀粉水解成葡萄糖的反应过程中同时发生着：水解反应、复合反应、分解反应；其中水解反应是主要的。 复合反应：葡萄糖分子问经16糖苜键结合成龙胆二糖（有苦味）、异麦芽糖和其他低聚

11、糖（合称复合低聚糖）。 分解反应：葡萄糖O羟甲基糠醛仃机酸、色素等淀粉的水解反应2、淀粉酸水解反应动力学属于单分子一级反应de1类型：=K9CK：反应速度常数，出由反应条件（如温度、酸度等）而定C:淀粉浓度de一了浓度对时间求导，浓度的降低 3、影响酸水解的因素 酸的种类 主要因素浓度（酸的浓度、淀粉的浓度）水解温度 （二）、葡萄糖的复合反应及其影响因素 复合反应：在淀粉的酸糖化过程中，水解生成的葡萄糖受酸和热的影响，葡萄糖分子之间通过糖昔键相聚合，生成二糖、三糖及其他低聚糖。2.、酸的影响:（三）葡萄糖的分解反应及其影响因素 葡萄糖羟甲基糠醛二乙酰丙酸、蚁酸、有色素物质； 影响因素：浓度、温

12、度、pH值;第三节糖蜜前处理一、糖蜜的来源与特点糖蜜的干物质浓度很高，约8090Bx,含糖量在50%以上，另含5%12%的胶体物质和10%12%灰分，此外产酸细菌多，某些糖蜜还含有较多的生物素。如不进行预处理，则微生物难于生长和发酵。近年来，由于制糖技术提高，糖蜜中糖的含量大大降低，可发酯性糖减少，非发醉性糖增加，胶体物质和灰分也显著增加，因此，糖蜜发醉前必须进行预处理。一、糖蜜的来源与特点二、糖蜜前处理的方法1、加酸通风沉淀法（冷酸通风处理法）：糖蜜加水稀释到500Bx=加入0.20.3%浓硫酸，通入压缩空气1h静置澄清8h,取上清液。2、加热加酸沉淀法（热酸通风沉淀法）：糖蜜加水稀释到40

13、%=加适量硫酸调节pH值到44.5=放入澄清槽加热至8090,通风30min保，0808绐心时，取上清液。糖蜜稀释至3040Bx-加硫酸调pH33.8=加热至90添加8Ppm聚丙烯酰胺（PAM）,搅拌均匀一静置1小时，取上清液。三、谷氨酸发酵糖蜜预处理 树脂处理法 亚硝酸处理法 2.添加化学药剂处理法 添加青霉素法 添加表面活性剂 添加抗氧剂法 3,追加糖蜜法 4.营养缺陷型变异株法心磷脂一 磷膈跳甘油 磷脂酰肌葬磷脂质n 石蜡璘脂皖肌醉二甘II糖昔量气乙二静 十七酸盐细胞膜细胞壁小磷酸甘油N酸二峻丙酮石蜡为碳源的磷脂合成途径乙酰CoA（拮抗）-柠椽战3 瞬酸甘油联乙限 IIH / /ci*K

14、G AL-GA-糖质或18酸为碳源的磷脚合成途径表面活性剂拮抗作用部位皿 油酸缺陷型遗传阻碍部位=甘油缺陷我的遗传阻碍部位细前细胞谷氨酸排出控制机制一、纤维素及发酵废液的处理 （一）、利用纤维素废料生产SCP 稻草、麦秆、玉米的茎和叶、甘蔗渣、废纸等 流程如下：I浓缩I干燥|磨碎）|成品）酸中和滤液生产恸:用茵利a:面卜级种司JL一级种A»中和废液IIk盐酸调PH3.5P发酵1离心分离）13膂鹘.输J粉碎J包装）二、亚硫酸盐废液的处理（一）亚硫酸盐制浆废液生产酒精和蛋臼质1、亚硫酸盐造纸制浆废液生产酒精2、亚硫酸盐纸浆废液发酵生产蛋白质3、亚硫酸铁法非木材制浆废液培养SCP（-）亚硫酸盐废液发醉生产乳酸三、木屑水解液发酵生产衣康酸第五节培养基灭菌 W消毒与灭菌在发酵工业中的. 消戏：指用物理和化学方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽抱。 火苗：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽泡和泡子。 消灭杂菌和防止杂菌污染 二、灭菌方法：干热灭菌、湿热灭菌、物理灭菌（射线、微波等）、化学灭菌（各种化学药品）； 1、干热灭菌法 灼烧灭菌、在电热或红外线在设备内加热主要用于保持干燥的物料、器具等紫外线、高速电子流的阴极射线、X射线和Y射线化学药品灭菌法（1）第一大类：表面消毒剂优点：1）蒸汽来源容易，操作费