不同细胞因子组合对人脐血单个核细胞体外扩增及CD49d和CXCR4表达的影响(1)

1、不同细胞因子组合对人脐血单个核细胞体外扩增及CD49d和CXCR4表达的影响(1)】 为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作用及扩增后CD49d和CXCR4的变化，将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7天，在0天，7天检测有核细胞数，CD34 细胞数及CD34 CXCR4 ，CD34 CD49d 的细胞数和集落形成单位(CFU)数.根据不同细胞因子组合实验分组为：对照组;SF组（SCF FL）; SFT组（SCF FL TPO）和SFT6组(SCF FL TPO IL-6)。结果表明，和对照组相比，SF组合仅能低水平支持脐血造血细

2、胞扩增，加入TPO后即SCF/FL/TPO组合能有效的扩增脐血细胞，但SFT和SFT6两组之间差异却无明显发生（P0.05）；SF，SFT和SFT6 3组的细胞因子组合均可提高脐血CD34 细胞CD49d，CXCR4的表达，但3组之间差异无显著性（P0.05）。结论： SF组合可协同扩增人造血细胞，但协同作用较弱；TPO在脐血造血干/祖细胞体外扩增中起重调节作用，而IL-6作用不显著;SCF/FL/TPO 3种因子组合不仅可促进脐血造血祖细胞的扩增，而且可上调脐血造血细胞CD49d，CXCR4表达。 【关键词】 脐血Effect of Different Cytokine Combinatio

3、ns on the Expression of CD49d and CXCR4 and Ex vivo Expansion of Umbilical Cord Blood Mononuclear CellsAbstractThis study was purposed to explore the effect of different cytokine combinations on the expansion of the mononuclear cells drived from umbilical cord blood （CB） ex vivo and expression of CX

4、CR4 and CD49d on CD34 cells after expansion.Human fresh CB mononuclear cells were cultured in serum-free and stroma-free medium containing different combinations of cytokine for 7 days.At day o and 7，the total cells were counted，CD34 cells and CD34 CXCR4 ，CD34 CD49d cells were assayed by flow cytome

5、try，and CFU were determined.According to the different combinations of cytokine，experiments were divided into four groups: control，SF group (SCF FL)，SFT group (SCF FL TPO) and SFT6 group (SCF FL TPO IL-6).The results showed that the SF (SF group) combination supported only low expansion of total cel

6、ls，CD34 cells and CFU.The addition of TPO in SF group restored UCB stem/progenitors expansion to a higher level than that in SF group，while there was no difference between groups SFT and SFT6 (P0.05).The cytokine combinations in groups SF，SFT and SFT6 all could upregulate the expression levels of CD

7、49d and CXCR4 on expanded cord blood CD34 cells，but there were no significant differences between groups SF，SFT and SFT6 (P0.05).It is concluded that SCF FL has no strong synergistic effects on primitive hematopoietic cells.TPO plays an important role in enhancing expansion of umbilical cord blood h

8、ematopoietic cells，while IL-6 only shows a neutral effect on it.SCF FL TPO combination not only promotes progenitor cells expansion but also upregulates the expression of CD49d and CXCR4 on CD34 cells from cord blood.Key words umbilical cord blood; cytokine combination; expansion ex vivo; mononuclea

9、r cell; CD49d; CXCR4脐血作为一种新的造血干祖细胞来源，目前已广泛的用于临床造血干细胞的移植，但是，由于单份脐血细胞所含的造血干细胞数量较少，且移植后中性粒细胞和血小板较骨髓和动员的外周血移植后恢复慢1，而体外扩增脐血细胞有望能解决这一问题。因此，对脐血造血祖细胞体外扩增已成为血液学研究的热点。理想的扩增方案应该能够促进造血祖细胞的增殖能力并且扩增后的细胞能够归巢到造血微环境和重建造血，这些与扩增体系中的细胞因子的选择和组合、扩增之后脐血细胞归巢和迁移能力有很大关系。本实验比较了不同因子组合对脐血造血祖细胞的扩增效率和扩增后归巢相关受体的变化，以确定最佳的细胞因子组合，为扩增

10、脐血临床应用提供理论基础。材料和方法标本的收集和制备10份脐血标本来源于本医院妇产科，采自健康正常分娩的胎盘组织，平均采集量为50-110 ml，肝素抗凝，24小时内用羟乙基淀粉（脐血羟乙基淀粉=51）混合，沉淀30-45分钟，吸取上层细胞，加在含人淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque 1.077 ）的10 ml离心管中（脐血人淋巴细胞分离液约=21），1800-2000转/分，离心25分钟，吸取细胞膜层部分，用PBS洗2次，用IMDM去黏附，2小时后调整细胞浓度备用。细胞因子及实验分组干细胞因子（SCF），FLT3配基（FL），血小板生成素（TPO），白介素-6（IL-6），均购于P

11、eprotech公司。SCF、FL、IL-6终浓度为50 ng/ml，TPO终浓度为20 ng/ml。根据不同细胞因子组合实验分组为：空白对照组，SF组（SCF FL），SFT组（SCF FL TPO），SFT6组(SCF/FL TPO IL-6)。脐血MNC体外培养StemspanTM培养液(Stemcell公司产品)含1%的BSA，10 g/ml胰岛素，200 g/ml转铁蛋白，10-4 mol/L 2-ME，2 mmol/L L-谷氨酰胺及IMDM。脐血MNC以终浓度为1106接种于25 ml培养瓶，培养体系为6 ml，置于37、5% CO2饱和湿度条件下培养7天，培养第3天半量换液，于

12、0，7天检测各项指标。造血祖细胞集落培养MethoCultTMGF(H4434)(Stemcell公司产品)含1%甲基纤维素，30% FB，1% BSA，10-4 mol/L 2-ME， 50 ng/ml rhSCF，50 ng/ml GM-CSF，10 ng/mlrh IL-3，3 U/ml rhEPO，造血祖细胞集落培养14天后于倒置显微镜下记数CFU 数。流式细胞术检测流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司FACS Vantage产品，使用CellQuest软件系统进行分析，用于人CD34 ，CXCR4 ，CD49d 细胞检测的单克隆抗体分别为APC标记的抗CD34单克隆抗

13、体，FITC标记的抗CD49d单克隆抗体，PE标记的抗CXCR4单克隆抗体。统计分析作者：毛平，许力，莫文健，应逸，许艳丽，林秀梅【摘】为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作 本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。运用SPSS统计软件包分析，数据采用均数标准差表示，组间比较采用方差分析。结果体外扩增过程中有核细胞数及CD34 细胞数，CFU数扩增倍数的变化经过7天培养，对照组有核细胞数及CD34 细胞数均较0天下降，而CFU数略高于

14、0天，SF组中有核细胞数，CD34 细胞数，CFU数分别增加至（10317），（21956）和（25996），SFT组分别中增加到（308161），（569281）和（449141）。培养7天后，SFT6组中有核细胞数和CD34 细胞数，CFU数也分别增加到（274128），（585251）和（535241）。SF、SFT、SFT6 3组组间比较，SFT组扩增效果优于SF组(P0.05)。SF、SFT、SFT6 3组与对照组相比，差异有显著性 (P0.05)（表1 ） 。Table 1.Increment of the absolute numbers of TNC，CD34 cells an

15、d CFU on day 7 of culture in different growth factor combinations(略)体外扩增过程后CD49d和CXCR4表达的变化培养7天，对照组CD34 CXCR4 ，CD34 CD49d 的细胞数均较0天下降，SF组，SFT 组，SFT6组CD34 CXCR4 ，CD34 CD49d 的细胞数分别较0天扩增到(6353)%和(309162)，(20481)%和(432214)，(22872)%和(413164)，和对照组相比，SF组、 SFT 组、 SFT6组的扩增效果均优于对照组，差异有显著性（P0.05）（表2）。Table 2. I

16、ncrement of the absolue numbers of CD34 CXCR4 ，CD34 CD49d cells after expansion of CB ( 略)讨论目前，国内外许多学者多使用分离纯化的CD34 细胞作为扩增培养的起始细胞，但是在分离纯化CD34 细胞的过程中不可避免造成干/祖细胞的损失，对于象脐血这样采集到的细胞数有限的移植物而言，最后的总细胞产量将受到明显影响。因此，对于体外扩增脐血细胞，分离纯化CD34 细胞似无必，且大多数黏附分子像CD49d，CD44，CXCR4不仅存在于早期造血细胞上，而且也存在于像单个核细胞和淋巴细胞这些有核细胞上。所以，CD34

17、 细胞和其他的有核细胞都表达和归巢有关的黏附分子和趋化因子受体2。此外，脐血造血干细胞移植，其植入的速度主和整个有核细胞记数有关，而不是和CD34 细胞记数有关3。因此，本实验选用单个核细胞作为扩增培养的起始细胞。国内外已有研究表明，不同的生长因子组合能够在无基质支持的培养体系中促进人造血细胞的扩增4，5，但对于何种细胞因子组合是最佳的组合目前尚未定论。一些研究证实，SCF、FL两因子可协同扩增人造血细胞，而TPO既可调控巨核细胞生成，又可促进早期造血细胞的增殖6。最近有研究认为，IL-6是一种早期细胞作用因子，能够维持G0期HSC/HPC的存活，并能促进早期细胞的扩增7，因此本实验将SCF、

18、FL、 TPO，IL-6 4种造血因子进行不同组合，探讨它们在脐血体外扩增中的作用。结果显示，经过7天的培养，各时间点FL和SCF 2细胞因子组合扩增人脐血造血细胞数较之对照组有轻度提高，这表明FL SCF组合在无基质悬浮培养体系中可协同扩增人脐血造血细胞，但协同作用较弱。然而在FL SCF组合的基础上，加入TPO后，发现有核细胞计数、CD34 细胞、CFU数在各时间点与SF组合比较，均能明显扩增脐血造血祖细胞，表明TPO可维持原始造血细胞的存活并能促进祖细胞的扩增。我们在FL SCF TPO 3因子组合的基础上再加入IL-6后，发现4因子组合虽然较对照组和FL SCF组合可有效地扩增脐血造血

19、祖细胞，但和FL SCF TPO 3因子组合比较起来，各时间点数据却无统计学意义(P0.05)。这表明IL-6在脐血造血祖细胞的体外扩增中不起明显的促进作用8，3因子组合（SCF FL TPO）对于体外扩增脐血是足够的。体外扩增的造血细胞能否重建造血首先需造血细胞能够归巢到受体骨髓微环境，而造血细胞的归巢是一个复杂的过程，其机制目前还不清楚。就目前研究的结果来说，造血细胞的归巢与黏附分子的表达、体外扩增时细胞因子的选择密切相关9。基质细胞衍生因子（SDF-1）在造血细胞的迁移、定居、增殖和分化中起着重作用，CXCR4是目前已知的SDF-1唯一受体，在多种造血细胞表面都有较高水平的表达，上调造血

20、细胞上CXCR4的表达能够增强人脐血细胞的植入潜能。CD49d是黏附分子家族的一个重成员，在移植后的细胞早期归巢到造血微环境起重作用，表达高水平的CD49d的细胞往往有较高的增殖活性，并能够增加移植细胞的植入能力10。因此，本实验探讨了不同因子组合对脐血单个核细胞体外扩增后CD49d和CXCR4表达的影响，结果发现，经过6天的培养，SF组、SFT组、SFT6组3组CD34 CXCR4 和CD34 CD49d 的细胞扩增倍数均优于对照组，差异有显著性（P0.05），这说明在SCF FL两因子组合的基础上加入TPO后，虽然可提高祖细胞的数量4，却不能提高CD34 细胞上CXCR4、CD49d的表达

21、。SFT组与SFT6组比较，差异仍无显著性（P0.05），提示IL-6在促进造血细胞的归巢方面可能不起作用10。有研究证实，造血细胞上黏附分子的维持或上调表达在扩增后的细胞能否植入受体起关键作用11，而能否植入受体取决于造血细胞能够归巢到造血微环境。本实验的结果显示，经 SF、 SFT、 SFT6 3组细胞因子介导的脐血细胞体外扩增均可提高脐血CD34 细胞上CXCR4、CD49d的表达，但表达水平无明显区别（P0.05），提示经三组细胞因子介导的脐血细胞经短期扩增培养后细胞的归巢能力均可得到提高，但三组因子扩增后的脐血细胞在归巢能力以至植入能力方面可能具有相同或类似的水平。由于体外扩增脐血最

22、佳的细胞因子组合目前尚未确定，而国外有学者支持将SCF FL TPO 3种因子组合作为扩增脐血祖细胞的最佳因子组合来应用于临床6，我们的实验结果显示，SCF FL TPO 3种因子组合不仅可促进脐血造血祖细胞的扩增，而且可上调脐血造血细胞上CD49d，CXCR4表达，支持将SCF FL TPO 3种因子组合作为扩增脐血合适的细胞因子组合而应用于临床。【参考文献】1 Jaroscak J，Goltry K，Smith A，et al.Augmentation of umbilical cord blood (UCB) transplantation with ex vivo -expanded

23、UCB cells: results of a phase 1 trial using the Aastrom Replicell System. Blood，2003;101: 5061-5067作者：毛平，许力，莫文健，应逸，许艳丽，林秀梅【摘】为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作 本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。2 Lee YH，Lee YA，Noh KT，et al. Homing-associated cell a

24、dhesion molecules and cell cycle status on the nucleated cells in the bone marrow，mobilized peripheral blood and cord blood.J Korean Med Sci，2004;19: 523-5283 Kurtzberg J，Laughlin M，Graham ML，et al.Placental blood as a source of hematopoietic stem cells for transplantation into unrelated recipients.

25、N Engl J Med，1996; 335: 157-1664 莫文健，毛平，何秋山等.无血清脐血巨核祖细胞体外扩增的研究.中国实验血液学杂志，2004； 12：133-1375 张洁霞，毛平.脐血细胞及红系祖细胞扩增的实验研究.中国实验血液学杂志，2005；13：429-4336 Levac K，Karanu F，Bhatia M.Identification of growth factor conditions that reduce ex vivo cord blood progenitor expansion but do not alter human repopulating cell function in vivo.Haematologica，2005; 90: 166-1727 Piacibello W，Sanavio F，Severino A， et al.Engraftment in nonobese diabetic/severe combined immonodeficient mice of human CD34 cord blood cells after ex vivo expansion: evidence for the amplifil