hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用

1、hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用         08-03-08 14:33:00     编辑：studa20     作者：孙玲，王峰，孙慧，乐晓萍，葛秀峰，姜中兴，张钦宪【摘要】  为了研究hTERT基因反义寡核苷酸（ASODN）对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用，并探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT基因表达的关系，应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞hTERT基因的表达，R

2、T-PCR方法检测该基因表达抑制情况，倒置显微镜观察细胞形态变化，MTT法检测细胞增殖状态，应用TRAP-ELISA、TRAP-PAGE方法检测HL-60细胞端粒酶活性。结果发现：反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后，hTERT基因表达明显受抑，细胞生长受抑，增殖能力减弱，其抑制作用具有序列特异性及浓度、时间依赖性。端粒酶活性检测显示：反义寡核苷酸10、20和30 mol/L作用组OD450-690值分别为1.504±0.47、1.223±0.39，0.944±0.16，与未作用组（2.648±0.42）比较，差异有显著性（P<0.05）

3、；正义寡核苷酸20 mol/L作用组（OD450-690值为2.376±065）与未作用组比较，差异无显著性（P>0.05）。TRAP-PAGE检测表明： hTERT ASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少，以30 mol/L作用组条带最少。结论： hTERT基因反义寡核苷酸能够通过封闭hTERT基因的表达而抑制HL-60细胞增殖，下调端粒酶活性。 【关键词】  HL-60细胞； hTERT； 反义寡核苷酸； 端粒酶活性Inhibition of hTERT Antisense Oligodeoxynucleotide on  Prolifera

4、tion and Telomerase Activity in HL-60 CellsAbstract  This study was purposed to investigate the inhibition of hTERT antisense oligodeoxynucleotide(ASODN) on the proliferation and telomerase activity in HL-60 cells and to explore the  relativity between the telomerase activity and the expre

5、ssion of hTERT gene in HL-60 cells. After treated by hTERT ASODN the expression of hTERT was detected  by RT-PCR，the morphological changes of HL-60 cells was observed with inverted microscopy，the cell proliferation was measured by   MTT method，and the telomerase activity was determine

6、d with TRAP-ELISA and TRAP-PAGE.  The results showed that after sealing hTERT gene with ASODN for 72 hours，the expression of hTERT gene was significantly inhibited，the  cell growth  was repressed and the ability of proliferation  decreased，and the effect was specific in sequence

7、and dependent in dose and time. OD450-690 values were 2.648±0.42，1.504±0.47，1.223±0.39，0.944±0.16  respectively，as the cells were treated with 0，10，20，30 mol/L ASODN  for 72 hours. The difference was significant as compared 10，20，30 mol/L groups with 0 mol/L ASODN group

8、 respectively (P<0.05)，but the difference was no significant when compared 20 mol/L SODN group (2.376±0.65) with untreated group (2.648±0.42) (P>0.05). TRAP-PAGE detection revealed that  comparing ASODN groups with SODN groups the telomerase image bands were decreased and least

9、was found in groups of 30 ±mol/L. It is concluded that the hTERT ASODN may inhibit the proliferation and down-regulate the telomerase activity in HL-60 cells by sealing the expression of hTERT gene.Key words  HL-60 cell; hTERT; antisense oligodeoxynucleotide; telomerase activity  

10、;  端粒是真核细胞染色体末端特有的保护性结构，它能维持染色体末端的完整性。随着细胞的分裂、分化，端粒逐渐缩短，当端粒缩短至一定程度，细胞将出现衰老、死亡。端粒酶是一种逆转录酶，它能合成端粒并接到染色体末端，补充由于DNA分裂造成的端粒缩短，从而维持端粒长度，使细胞永生化1。研究表明：端粒酶活性增高与许多肿瘤的发生密切相关，在急性白血病中存在端粒酶的高表达2。人们普遍认为，端粒酶活化是肿瘤细胞无限增殖的必要条件。抑制端粒酶的活性可以达到抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡的目的。人类端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTRET

11、）基因与端粒酶活性具有直接相关性3。我们利用反义技术将hTERT反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide，ASODN）导入人类髓性白血病细胞株HL-60细胞，探讨其对白血病细胞的增殖及端粒酶活性的影响，为开辟白血病治疗新途径提供有价值的实验室资料。材料和方法细胞培养HL-60细胞为郑州大学医学院组胚教研室保存株，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，将HL-60细胞置37、5% CO2、饱和湿度的恒温孵箱中培养。实验选用对数生长期细胞，细胞悬浮成团，生长良好，隔天换液并传代1次，成活率>95%。反义核酸的设计与合成选择端粒酶hTERT mRNA

12、转译起始区作为靶点合成全硫代修饰的反义寡核苷酸（ASODN）片段；另设正义全硫代修饰的寡核苷酸（SODN）片段作为对照。合成序列如下：  h-ASODN: 5-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3；   h-SODN: 5-CCCGCGATGCCGCGCGCTCC-3。经计算机检索证实，反义片段与其它已知的人类基因无同源性。所有寡核苷酸均由上海Sangon生物工程技术服务公司391型DNA合成仪(PE公司)合成，并纯化、分装，-20保存待用。转染及药物敏感试验按照OligofectamineTM Reagent(Invitrogen公司)说明书步骤，将纯化的ASOD

13、N、SODN溶于不含抗生素及胎牛血清的RPMI 1640培养液中，每组浓度分别为5、10、20、30 mol/L。取2.5 l不同浓度的ASODN分别加入40 l无血清培养液，此为液；6 l无血清培养液中加入1.5 l转染液，室温孵育10分钟，此为液。将液分别加入液中，轻轻混匀，室温放置15-20分钟。同时取对数生长期的HL-60细胞200 l (含细胞1.5×105)，加入A、B液调成250 l，接种于24孔板中，置5%  CO2孵箱中转染4小时后，加入新鲜的含30%胎牛血清的RPMI 1640液125 l继续培养，每个浓度组均设立3个平行复孔。同时设未作用组为空白对照(

14、即不加任何寡核苷酸作用的HL-60细胞)。分别培养24、48、72、96小时，用MTT法测定细胞生长抑制率。测定前4小时加入MTT液，4小时后加入溶解液DMSO，待结晶完全溶解后于全自动酶标仪上在波长490 nm处测定每孔吸光度OD490。计算生长抑制率：生长抑制率=(未处理组吸光度-处理组吸光度)/未处理组吸光度×100%细胞形态学观察在细胞培养状态下，用倒置显微镜观察细胞生长状态及形态学改变。细胞增殖能力检测取对数生长期HL-60细胞，调整细胞浓度为5×104/ml。用20 mol/L ASODN、SODN分别转染细胞，每组设3个复孔。常规培养24、48、72、96小时

15、后采用4 g/L台盼蓝染色，计数板计数法进行细胞计数，以时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线。         转染细胞hTERT mRNA表达的检测于转染后72小时收集不同处理组HL-60细胞3×106个，以TRIZOL RNA提取试剂盒提取细胞的总RNA。采用AMV一步法RT-PCR试剂盒检测hTERT mRNA的表达。hTERT上游引物：  5-CTGGGTGGCACGGCTTTTGTTC-3，hTERT下游引物: 5- GGGCTGCTGGTGTCTGCTCTCG-3；以-ac

16、tin为内参照，上游引物：5-TCCTGTGGCATCCACGAAA-CT-3，下游引物：5-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3。产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果并拍照成像。端粒酶活性检测用Telomerase PCR ELISA试剂盒（Roche公司产品）进行检测。端粒酶提取物的制备  收集2×105个细胞，用PBS洗2次，加入200 l裂解液。充分混匀，4裂解30分钟，16 000×g离心10分钟，小心地将上清(约175 l)移至另一洁净管中，-70保存备用或即用。紫外吸收法测定蛋白质含量。阳性对照为人胚肾细胞293细胞株(试剂盒提供)，阴

17、性对照为端粒酶提取物加1 g/l  RNase A，37孵育20分钟。RT-PCR扩增  取上述提取液5-20 l(蛋白质含量10 g)加入25 l 反应混合液，用无菌DEPC水补充至50    l，加入PCR扩增管。PCR扩增: 25引物延伸30分钟;94端粒酶灭活5分钟;扩增反应: 94 30秒，50 30秒，72 90秒，循环30次;72平衡10分钟。端粒酶活性的TRAP-ELISA检测  取上述PCR产物5 l加变性液20 l混匀，室温放置10分钟，加入225 l杂交液(含地高辛标记的探针)，混匀后取出100 l放于包被抗生物

18、素的酶标板中，20作用2小时，加入过氧化物酶并与TMB底物显色30分钟，最后加终止液100 l，用时间分辨荧光仪测定A值(波长为450 nm和690 nm)，A=OD450-OD690。A值代表细胞端粒酶活性。聚丙烯凝胶电泳及银染 配12%非变性聚丙烯凝胶，聚合1-2小时，小心取出梳子，立即冲洗加样孔，加入扩增产物25 l，130 V电泳1.5-2小时，(电泳50%的胶长)取出凝胶进行银染。先将凝胶放入10%的乙醇中固定10 分钟，用ddH2O清洗1次；1%硝酸溶液中浸洗3分钟，用ddH2O清洗2次；0.2%硝酸银浸洗30分钟进行染色，用ddH2O清洗2次；0.28 mol/L碳酸钠并0.019%甲醛显色至特异性梯形条带现出；10%醋酸浸洗2分钟进行分化