NPM1基因突变在急性髓系白血病中的作用_图文

1、 576亟警医堂垫!Q笙!旦筮呈!鲞笙!塑丛型坠!坠婴:!垡:21:型!:!:出:!Q!Q前抽取骨髓5ml,肝素抗凝,采用直接法及不加植物血凝素的短期培养法制备染色体标本,然后采取改良的热处理吉姆萨R显带技术分析20个以上分裂象细胞核型,核型按“人类染色体国际命名体制(ISCN2005”进行描述。1.2.2基因组DNA提取患者在获得知情同意后抽取骨髓液5ml用于常规免疫表型和细胞遗传学分析,剩余骨髓液用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,采用传统酚一氯仿抽提法提取DNA,应用紫外分光光度仪测定样本的OD值,去离子水稀释DNA至50ng/Ixl,一20保存备用。1.2.3NPMl基因扩增NPMI基凶

2、第12外显子引物的设计合成按文献2,正义链:57一TYAACTCTCT-GGTGCTAGAATGAA一3;反义链:57一CAAGACTATYI'GCCATrCCTAAC一3(上海英竣公司。PCR 总体系25出,反应条件:95预变性5min,9445 s.56oC45s,72oC45s,共40个循环,最后72延伸10min,4保存。PCR产物在2g/L琼脂糖凝胶上进行电泳(110V,30min,EB染色后紫外灯下观察目的条带约为560bp。扩增产物用5一AAAAGGACAGCCAGATATCAAC一3测序引物进行直接测序,结果与正常序列比对,在测序引物后80bp范围内出现重叠峰的标本为N

3、PMI基因突变阳性标本。1.2.4克隆测序直接测序法筛选出NPMI突变型标本,对PCR扩增产物回收并纯化,用pUCmT载体(上海英竣公司产品进行克隆测序,结果用BLAST与正常序列比对分析突变发生的位置和类型。1.3统计学处理采用SPSSl6.0软件。计数资料采用x2检验,计量资料采用独立样本t检验,P< 0.05为差异有统计学意义。2结果2.1基因突变分析NPMl基因突变分析:正常健康对照者未发生NPMI基因突变,39例AML患者标本PCR扩增产物进行直接测序后发现NPMI杂合突变型7例,在测序引物后80bp范围内部分出现重霍峰形(图1。克隆测序显示:A型突变6例,于NPM 960bp

4、处插入TCTG4个碱基(图2,B型突变1例,于NPM960bp处捅入CATG4个碱基。2.2NPMl基因突变患者及细胞遗传学特征分析2,2.1染色体核型分析39例AML患者染色体核型分析结果显示,4例患者无分裂相,22例正常核型中NI,M1突变阳性为27.3%(6/22,而13异常核型患者NPMl突变阳性为7.7%(1/13,两者有统计学意义(P<0.01,并且异常核型15H性患者为复杂核型,其他伴t(15;17、inv(16、t(8;21患者中均未检测到NPMl突变。2.2.2FAB亚型分析除M3外其他MI、M2、M4、 M5及M6均有NPMI突变发生。煎鳘医堂垫!Q生!旦筮;!鲞筮!

5、弱丛型业i!坠堕:!:!:盟!:!:!k!Q!Q 图1直接测序法筛选NPMl基因突变型结果A.NPMl基因野生型;B.A型突变直接测序结果;C.B型突变直接测序结果 图2NPMl基因A型突变克隆测序结果(方框内代表插入序列2.2.3临床特征分析及预后NPMI基因突变患者初诊时白细胞计数明显高于野生组,具有统计学意义(P<0.05,其他指标如血红蛋白、血小板计数、骨髓原始细胞比例差异无统计学意义(P>0.05。NPMI基凶突变患者具有较高的CR率。3讨论NPMl是一种体内蕴含丰富、高保守的、编码核质穿梭的核磷蛋白,在细胞中广泛表达并起着分子伴侣的作用,对多种细胞牛物过程起作用,包括核

6、糖体合成,保持基因稳定性,调节肿瘤抑癌基冈如p53活动和稳定性,对转录因子的i周控作川等,进而调控细胞的增殖发育【2l。2005年意大利Falini等旧。对NPMl基凶第12号外显子突变与急性髓系白血病(AML关系的研究发现,该突变在AML成人中检出率达35.2%,AML正常核型检出率为61.7%。随后的研究表明,NPMl在AML成人正常核型中发生率为50%60%¨冉1。笔者通过直接测序的方法在39例AML患者中共检出NPMI突变7例(17.9%,22例正常核型发生率27.3%(6/22,较文献1,2报道少,可能与样本量少有关,异常核型分析发现NPMI在预后良好核型如t(8;21,t

7、(15;17,inv(16未见突变,而在复杂核型中少见,与文献6,7报道相近。本研究发现,NPMl突变患者具有初诊时白细577胞计数偏高的特点,特别是当其合并有FI邝一ITD突变时,表现更明显。与FLT3一ITD不同的是,单纯NPMl+患者初诊时血小板计数较高,可能与NPMl+患者骨髓中巨核细胞数量增加和发育异常的特征有关L8j,有待进一步扩大样本分析。本研究还发现NPMl基凶突变可见于除M3型外的其他亚型,与可随访预后的患者CR率相比较,显示NPMl 突变患者预后较好,与文献13,8一lO报道一致。大量研究证实,NPMI突变多发于正常核型,有11%15%的NPMl突变发生在除核型正常以外的患者,同时合并各种细胞遗传学异常改变¨。3911|。但其在异常核型的发生及意义尚不十分清楚,有赖于进一步增加样本量进行研究。同样AML伴有单纯NPMl突变的患者具有良好的预后,因此可单独将NPMl+患者从WHO分类中独立出来,划为一个整体,并给予特异性的治疗,值得进一步地研究。【参考文献】1VerhaakR G,Goudswaard c S,Van PuttenW,et a1.Mutations innucleophosmin(NPM Iinacutemyeloidleukemia(AML:association with other gene abnormalities