微量凯氏定氮法测定蛋白质含量

1、1南昌丸爭实验报告实验课程：微量凯氏定氮法测定蛋白质含量学生姓名：_xxx_学 号: _XXX_专业班级： _XXX_22017年4月11日实验背景：凯氏定氮法： 测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。 该方法 在有催化剂的条件下， 用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机 铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨， 随水蒸气馏出并为过 量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由 于蛋白质含氮量比较恒定，可由物质含氮量计算其蛋白质含量， 故此法是经典的蛋白质定量方法。一、 实验目的1、掌握凯氏(Kjeldahl)定氮法测定蛋白质含量的原理方法；2、学会使用凯式定氮仪。二、 实验原理蛋白质

2、是含氮的化合物。 凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸 共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后 有机氮转变为无机氮硫酸铵， 这一过程称为有机物的消化。 消化 完成后， 将消化液转入凯氏定氮仪反应室， 加入过量的浓氢氧化 钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液 接收瓶内，硼酸接收氨后，形成四硼酸铵，然后用盐酸标准溶液 滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。 滴定消耗的标准盐 酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。 测定出 的含氮量是样品的总氮量， 其中包括有机氮和无机氮。 以甘氨酸 为例，其反应式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4f2

3、CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)2NH3+H2SO4f(NH4)2SO4(2)3(NH4)2SO4+2NaOHf2H2O+Na2SO4+2NH3T(3)三、实验器材和试剂1、实验器材：凯氏定氮蒸馏装置、50ml锥形瓶3个、酸式滴定管、酒精灯2、实验试剂：浓硫酸、30%氢氧化钠溶液、2%硼酸指示剂0.2M HCL四、实验步骤1、定氮仪的洗涤1）测定前定氮装置如下法洗涤23次：从样品进口入加水适 量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗 冷凝管，数分钟后关闭夹子P3,使反应管中的废液倒吸流到反应 室外层，打开夹子P1由橡皮管排出，如此4数次。（2）用蒸汽洗涤反应室约10mi

4、n后，在冷凝管末端小玻璃管的 位置放上一个盛硼酸-指示剂混合液的锥形瓶，将瓶倾斜，以保 证冷凝管末端连接的小玻璃管完全浸于液体内。继续蒸馏12min。观察锥形瓶内溶液是否变色， 如不变色，则证明反应室 内部已洗涤干净；如果混合液变绿，说明定氮仪内有残留氨，没 有洗涤干净，需要进一步用蒸汽洗涤。2、蒸馏（1）准备工作： 蒸馏器洗净后， 开放水龙头P3,使水进入A室，水放至A室球部2/3处即可。取3个50ml的锥形瓶，分别加入10ml硼酸（内加有混合指示剂） 。用表面皿复盖备用。（2）加样：用移液管吸取2ml消化液，小心地由漏斗D倾入B室，用少量蒸馏水冲洗漏斗D。取一个盛有硼酸的锥形瓶，置于M管下

5、，使管口置于硼酸溶液液面以下，将P4夹紧,向漏斗D加入30%氢氧化钠5ml，慢慢松开P4，使氢氧化钠进入B室， 但漏斗中始终保持一部分液体封闭， 往漏斗加入少量蒸馏水， 重 复以上过程，全程都要保持漏斗中的液体封闭。（3）蒸馏：用酒精灯加热，维持火力恒定，沸腾不可高于Y管口以免A室溶液从Y管倒吸，待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端 滴下时起，继续蒸馏5分钟，然后将锥形瓶放低，使导管离开液 面再蒸2分钟，最后用蒸馏水洗导管外壁，蒸馏完毕，取下锥形 瓶准备滴定。（4）空白蒸馏：用移液管分别吸取2ml蒸馏水按上述操作步骤 进行蒸馏。53、滴定蒸馏完毕，用微量酸式滴定管，以0.01mol/L盐酸标准溶液滴定

6、 锥瓶内溶液，溶液由蓝绿色变为淡紫色或灰色，即为终点。记录 所用盐酸的量。五、实验结果处理1、实验数据实验次序123实验试剂空白样品1样品2蒸馏水/ml100样液/ml011NaOH/ml555消耗HCI/ml0.050.850.80平均值0.050.8252、计算：（A B） x 0 214样品的总氮含量（） =（）100CM 1000 X 10若测定的样品含氮量部分只是蛋白质则: 样品的总蛋白含量（%）=（A_B）0葬625100Cx 1000 x 10式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数；B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；C为称量样品的毫升数；0.2为盐酸的当量 浓度（实际上，此项应按

7、实验中使用盐酸的实际浓度填写）；14为氮的原子量；6.25为常数;100是配出的100ml消化液；10是6面粉质量10g样品的总蛋白含量（%）=：（.825一0.05）214&25100 = 13.57%1 1000 10由资料知面粉含量如图从写级二看，我们又可以把面粉分九特等粉、一竽粉、二等粉等各个等级蛋白睫|特諄粉7 2127o.4a高瀚面包冃10.70.45法弍茴包用二躺1150 54面包月该实验数据测得的蛋白质量略高出标准值六、误差分析与讨论1、误差分析（1）通常情况下，蛋白质含氮量在16%左右，其F值为6.25。但是，实际上不同来源的蛋白质的氨基酸组成差别很大，含氮量的差别也

8、很大，如乳制品、面粉、花生的蛋白质含氮量分别为15.67%、17.54%和18.32%，则它们的F值分别为6.38、5.70和5.46。而计算中取F为6.25,会导致蛋白质含量值偏大。（2）样品在空气中易变质；（3）实验用于滴定的HCI浓度过高，导致空白对照组仅滴定一滴便达到滴定终点，易产生操作误差；2、问题讨论实验中应该注意些什么？本法适用于0.05-3.0mg氮，样品中含氮量过高时， 则应减少取 样量或将样液稀释。7勿使样品粘于烧瓶颈部。 放置液体样品时， 需将吸管插至烧瓶 底部再放样：如固体样品， 可将样品卷在纸内， 平插入烧瓶底部， 然后再将烧瓶直起，纸卷内的样品即完全放在烧瓶底部。参考文献：中国知网 百科, 凯式定氮法GB/T 5009.5 200