双色荧光原位杂交检测c-erbB-2基因扩增及应用

1、    双色荧光原位杂交检测c-erbB-2基因扩增及应用        c-erbB-2(HER-2/neu)癌基因编码一种跨膜酪氨酸激酶受体蛋白，该蛋白与表皮生长因子受体家族有广泛的同源性。有研究表明，c-erbB-2蛋白与某些实体肿瘤细胞间的信号传递有关。c-erbB-2基因的过度表达可影响细胞受体的激酶活性，从而影响或改变细胞的生长、增殖特性。经研究发现，c-erbB-2原癌基因的过度扩增或蛋白异常表达与乳腺癌、胃癌等实体瘤的发生、发展及预后密切相关，而且具有c-er

2、bB-2基因过度表达的乳腺癌可对一种人源化的重组抗c-erbB-2抗体(Herceptin)有较好的治疗反应1，2。因此，c-erbB-2基因过度表达的确定，不仅可作为判断肿瘤病人预后、估计病情病期的重要参数，而且对于指导治疗有十分重要价值。我们采用双色荧光原位杂交(dual-colors fluorescence in situ hybridization)技术检测胃癌病理切片中c-erbB-2基因扩增，以了解c-erbB-2基因在这类肿瘤中是否扩增及其发生率，并对该基因诊断的价值进行初步评价。一、材料与方法1.病理切片来源及一般资料：（1）胃癌病理切片20份，来自我院病理科，均为手术或活检

3、标本，甲醛固定后，常规石蜡包埋，切片；病理形态学类型包括腺癌16例(级)，印戒细胞癌4例。（2）一般资料：20例胃癌患者，男11例，女9例，年龄范围2567岁，平均年龄43.5岁。乳腺癌组织病理切片(c-erbB-2：CEP 17号染色体阳性)来自美国南加州大学病理科，用作阳性对照。2双色FISH检测c-erbB-2基因扩增：（1） 检测试剂：PathVysionTMHER-2 DNA探针盒购自美国Vysis公司，该探针盒内含LSI HER-2 spectrum orange(含低拷贝E. Coli载体数)/ CEP 17 Spectrum Green DNA探针(E.Coli质粒)，其中Sp

4、ectrum Green荧光标志的-卫星DNA探针作为17号染色体标志；Spectrum Orange荧光标志的DNA探针作为c-erbB-2基因位点标志。NP-40蛋白酶由试剂盒提供，DAPI反染色液，20×SSC由本室配制。（2） 荧光显微镜系Olympus BX-50型，DAPI/FITC/TXRD三波段滤镜由Chroma Technology公司特制。（3）荧光原位杂交大致程序：病理切片预处理，依次用二甲苯脱蜡，100%乙醇脱水、干片；拷片；然后用蛋白酶消化，洗涤，干片；荧光原位杂交程序：样本DNA变性；探针预处理；杂交：每片加10 l探针混合液到肿瘤细胞靶区域(HE染色阅片

5、证实，大约20 mm×20 mm范围)，加塑料盖玻片，37孵育过夜；杂交后洗涤，加10 l/片DAPI反染色液，荧光显微镜下计数荧光信号。（4）靶信号计数及结果判定：根据试剂盒提供的双色信号计数指导，使用1 000×油镜，计数每个细胞核内的绿色及桔红色荧光点，选择胞核不相互重叠，荧光信号不相互重叠的区域进行计数。每片计数20个间期细胞核的荧光信号，算出“红色信号绿色信号”比率的均值，以c-erbB-2:CEP17信号比率2.0判定为c-erbB-2基因扩增。二、结果1.c-erbB-2基因扩增阳性的乳腺癌病理切片FISH结果：来自c-erbB-2基因扩增的乳腺癌病理切片阳性

6、对照结果显示，该例存在c-erbB-2基因的过度表达。c-erbB-2:CEP17=3.51，c-erbB-2基因拷贝信号呈“丛集”趋势，而17号染色体标志信号在细胞核中表现为2个绿色荧光点（1）。证明该实验体系工作。2.胃癌组织c-erbB-2基因的表达：20份胃癌病理切片，c-erbB-2:CEP17比值有16份<2.0，其平均比值为1.2；4份比值>2.0，平均比值为4.40，提示有c-erbB-2基因扩增，c-erbB-2基因过度表达在本组胃癌病例的发生率为20%。值得注意的是4例 c-erbB-2基因扩增的胃癌均为腺癌级，平均年龄也偏大( 53.0岁)，而4例印戒细胞癌，

7、无1例出现c-erbB-2基因扩增。2显示c-erbB-2基因扩增阴性的胃癌病理切片FISH结果。三、讨论c-erbB-2是酪氨酸激酶超家族内皮生长因子受体（EGFR）家族中的成员，该激酶是细胞通过激酶级联传递信号途径中的重要环节，参与细胞生长及分裂的调节。c-erbB-2基因定位于染色体17q1221.3，编码的蛋白系HER2/P185 erbB2。HER2/neu基因的过度表达主要见于乳腺癌、下颌癌、胃癌细胞株MNK-7等，它通常与肿瘤分级及预后相关。Brien等3用FISH技术分析61例胃腺癌病理切片中的c-erbB-2基因表达，并与其他分析指标（包括cyclin A, cyclin B

8、1, P34cdc2, P120, 增殖细胞核抗原）等进行比较。结果表明，43%的胃腺癌存在c-erbB-2基因扩增，并与胃癌的病理学分级及患者的生存期呈相关。Ishikawa等4报道用FISH技术检测胃腺癌组织c-erbB-2基因，105份标本中有19份表现出高水平的c-erbB-2基因扩增(阳性率为18.1%)，其中15例表现出癌基因荧光信号成簇分布。本组20例胃癌病例，4例表现有c-erbB-2基因扩增，发生率为20%；而仅从胃腺癌角度考虑，其发生率为25%，与Ishikawa等4报道的结果相似。值得注意的是，4例胃印戒细胞癌，无1例有c-erbB-2基因过度表达，这是偶然现象或是必然事

9、件，有待扩大样本量才能结论，而4例c-erbB-2过度表达的胃癌，病理分级均为级，患者平均年龄偏大(范围3867岁，平均53岁)，提示c-erbB-2基因扩增与胃癌病理分级相关。 1双色FISH检测乳腺癌组织切片c-erbB-2基因扩增（阳性对照），绿点代表CEP17，红点为c-erbB-2基因双色荧光原位杂交×1 0002示1例胃腺癌病理切片：双色FISH检测c-erbB-2基因，c-erbB-2:CEP17比值在1.0左右，表示不存在c-erbB-2基因扩增双色荧光原位杂交×1 000我们的结果表明，用FISH技术可以较准确地反映c-erbB-2基因过度表达与否，并能分

10、析间期细胞c-erbB-2基因的拷贝数，结果直观、可靠。新近，美国已经将一种针对c-erbB-2基因产品的重组基因工程产品Herceptin用于具有c-erbB-2过度表达的乳腺癌患者，取得较好的临床效果5。对于具有c-erbB-2过度表达的其他实体瘤（如胃癌、涎腺癌等），也有使用Herceptin的指征。因此，FISH技术检测实体瘤组织c-erbB-2基因扩增与否，不仅帮助揭示肿瘤发生、发展、转移的分子机理，而且对于Herceptin治疗适应征的选择，具有实际的导向意义。基金项目：美国中华医学基金会资金资助项目(99-698)作者单位：张广森（湖南医科大学附属第二医院分子血液病研究室4100

11、11 长沙）肖乐（湖南医科大学附属第二医院分子血液病研究室410011 长沙）陈永恒（湖南医科大学附属第二医院分子血液病研究室410011 长沙）周见远（美国南加州大学医学院病理系）张新民（湖南医科大学附属第二医院病理科）参考文献1，Mizutani T, Onda M, Tokunaga A, et al. Relationship of c-erbB-2 protein expression and gene amplification to invasion and metastasis in human gastric cancer. Cancer, 1993,72:2083-2088

12、.2，Ross JS, Fletcher JA. The HER-2/neu oncogene in breast cancer: prognostic factor, predictive factor, and target for therapy. Stem Cells, 1998,16:413-428.3，Brien TP, Depowski PL, Sheehan CE, et al. Prognostic factors in gastric cancer. Mod Pathol, 1998,11:870-877.4，Ishikawa T, Kobayashi M, Mai M, et al. Amplification of the c-erbB-2 (c-erbB-2) gene in gastric cancer cells. Detection by fluorescence in situ hybridization. Am J Pathol, 1997,151:761-768.5，Pegram MD, Lipton A, Hayes DF, et al. Phase study of receptor-enhanced chemosensitivity using recombinant humanized ant