人GITRaa27-165蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

1、人GITRaa27-165蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备               作者：仝佳, 王胜军*, 陈君, 毛朝明, 杨云良, 杨敏, 胡正军, 只棣媛, 许化溪   【摘要】  目的: 表达和纯化人GITR胞外段（hGITRaa27-165）融合蛋白, 制备hGITRaa27-165融合蛋白的兔源性多克隆抗体(pAb)。方法: 利用PCR从pGEM T?hGITR获得hGITRaa27-165编码序列, 将其亚

2、克隆至原核表达载体pQE30, 构建重组表达质粒pQE30?hGITRaa27-165; 将阳性重组质粒转化大肠杆菌, IPTG诱导表达融合蛋白, 通过Profinity IMAC Ni?Charged Resin亲和层析柱进行纯化; 纯化蛋白免疫新西兰大白兔, 获取多克隆抗血清并利用Protein A Sepharose柱进行纯化, ELISA法检测抗体效价, Western blot法检测抗体特异性。结果: 构建了pQE30?hGITRaa27-165原核表达载体, 原核蛋白hGITRaa27-165蛋白以包涵体形式在大肠杆菌得到高水平表达, 通过复性与亲和层析获得纯度在90%以上的hGI

3、TRaa27-165蛋白, 蛋白浓度为400 mg/L, 制备的抗hGITRaa27-165多抗效价高达11.6×105, Western blot鉴定其具有良好的特异性。结论: 获得高纯度hGITRaa27-165蛋白, 并制备特异性pAb, 将为进一步研究hGITR的生物学功能提供实验基础。 【关键词】  hGITR 原核表达 多克隆抗体 Prokaryotic expression of human GITRaa27-165 and preparation of its polyclonal antibody TONG Jia, WANG Sheng?jun*, CH

4、EN Jun, MAO Chao?ming,  YANG Yun?liang, YANG Min, HU Zheng?jun,  ZHI Di?yuan,  XU Hua?xi Department of Immunology and Laboratory Immunology, School of Medical Technology; Department of Ophthalmology,  the Affiliated Hospital; Class 3, Grade 2004, Laboratory Medicine of  Jian

5、gsu University, Zhenjiang 212013, China Abstract  AIM: To express and purify the extracellular region of human glucocorticoid?induced tumor necrosis factor (hGITRaa27-165), and to prepare and identify the polyclonal antibody (pAb) against this fusion protein. METHODS: The 429 bp DNA sequence of

6、 hGITRaa27-165 was obtained from pGEM T?hGITR by PCR and then it was inserted into pQE30 plasmid to construct the prokaryotic expression plasmid pQE30?hGITRaa27-165. pQE30?hGITRaa27-165 was transformed into E.coli. The target fusion protein was expressed with the induction of Isopropyl ?D?1?thiogala

7、cto? pyranoside (IPTG) and purified by Ni2+?NTA affinity chromatography column. The antiserum against hGITRaa27-165  was obtained from the rabbits immunized with hGITRaa27-165. The titer of pAb was detected by ELISA and the specificity of pAb was identified by Western blot. RESULTS: The prokary

8、otic expression plasmid pQE30?GITRaa27-165 was constructed successfully.  The culture condition in which the target fusion protein was highly expressed was found out: the optimal concentration of IPTG was 0.5    mmol/L,  the culture temperature was 30 and the culture time wa

9、s 6 h. The GITRaa27-165 fusion protein was effectively expressed in E.coli as inclusion body. Soluble protein was obtained through denaturation and refolding procedure. The fusion protein was purified by Profinity IMAC Ni?Charged Resin affinity column with above 90% purity. The anti?GITRaa27-165 pAb

10、 was prepared by immunizing the rabbits with the purified target fusion protein. ELISA showed the titer of pAb was 11.6×105. Western blot analysis confirmed anti?GITRaa27-165 pAb was of good specificity. CONCLUSION: The fusion protein hGITRaa27-165 with high purity has been obtained and the

11、0;  anti?hGITRaa27-165 pAb with high titer and good specificity has been prepared. Our study may be conductive to further research into the molecular mechanism of action between  human GITR and GITRL.    Keywordshuman glucocorticoid?induced tumor necrosis factor recepto

12、r; prokaryotic expression; polyclonal antibody 糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid?induced tumor necrosis factor receptor, GITR）是肿瘤坏死因子受体超家族（TNFR superfamily, TNFRSF）的新成员1, 高表达于调节性T细胞（Treg）。人类GITR及其配体于1999年分别被克隆成功2。初步实验研究中表明, 在正常小鼠体内, GITR信号通路活化后, 可以通过抑制Treg细胞的功能和直接发挥共刺激作用, 促进效应性T细胞的增殖3, 4, 进而影响多种免疫进程。然

13、而, 研究中发现人类GITR与小鼠GITR在体内外实验中表现不同5, 迄今为止,  有关人GITR分子在免疫系统发育以及在病理生理过程当中的作用仍不明了。我们通过工程菌表达人GITRaa27-165重组蛋白, 以Ni2+?NTA亲和层析柱纯化蛋白后免疫家兔, 制备相应多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）, 并初步探讨此pAb对人CD4+T细胞增殖能力的影响。为进一步探讨人类GITR分子的生物学功能奠定了基础。 1  材料和方法 1.1  材料  聚蔗糖泛影葡胺液购自上海生工生物工程技术服务有限公司; RPMI1640培养基购自美

14、国Gibco公司; PCR纯化试剂盒、 T4 DNA连接酶购自Promega公司; 高GC BufferI、 LA Taq DNA聚合酶、 dNTP、 限制性核酸内切酶、 DL 2000和EcoT14I Mr标准Marker均购自TaKaRa公司; IPTG、 PHA购自Sigma公司; 琼脂糖购自上海求德生物化工有限公司; ECL发光底物和Protein A Sepharose购自GE Healthcare公司; 蛋白Mr Marker购自Fermentas公司; Profinity IMAC Ni?Charged Resin亲和层析柱购自Bio?rad公司; 抗人GITR单克隆抗体（mAb

15、）购自Biolegend公司; HRP?羊抗兔IgG购自北京中山生物技术有限公司; HRP?羊抗小鼠IgG购自美国KPL公司; FITC标记羊抗兔IgG购自Zymed公司; 人CD4+T Cell Isolation Kit II购自Miltenyi Biotec公司; pGEM T?GITR、 原核表达载体pQE30、 感受态细菌E.coli JM109和E.coli M15由本室保存; 健康雄性新西兰大白兔（体质量2.53 kg）, 由江苏大学动物实验中心提供。 1.2  方法 1.2.1  GITRaa27-165基因的扩增  根据GenBank中人GITR

16、基因（序列号为AY358877）胞外段序列（GITRaa27-165）以及pQE30多克隆位点, 通过Primer Premier 5.0软件设计特异性引物, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。正义链引物5端加BamH I酶切位点, 序列为: 5?AA GGATCC CGC CCC ACC GGG GGT C?3, 反义链引物5端加Hind 酶切位点, 序列为: 5?GGG AAGCTT CCA CCC AAG CGG CTC TGC?3。以本室已制备成功pGEM T?GITR质粒6为模板, 进行PCR, 扩增条件是: 94 5 min预变性, 94变性30 s, 66退火30 s, 7

17、2延伸30 s, 共28个循环。PCR产物在琼脂糖(10 g/L)凝胶上进行电泳, Genius凝胶电泳图像分析系统分析鉴定。    1.2.2  GITRaa27165基因表达载体的构建与鉴定  将pQE30载体和上述目的基因的PCR回收纯化产物分别进行BamH I、 Hind 双酶切, 37过夜。酶切产物在(10 g/L)琼脂糖凝胶上进行电泳, 按照Promega公司胶回收试剂盒步骤要求进行胶回收。将BamH I和Hind 双酶切并回收纯化后目的基因GITRaa27-165和载体质粒pQE30, 按51的摩尔浓度比例, 用T4 D

18、NA连接酶连接, 16, 过夜7。转化感受态E.coli JM109菌, 挑取单个菌落37摇菌过夜。提取质粒进行PCR及酶切鉴定, 阳性质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。 1.2.3  GITRaa27-165蛋白的诱导表达与Western blot鉴定  将鉴定正确的pQE30?GITRaa27-165重组质粒转化至工程菌E.coli M15, 挑单个菌落至3 mL LB培养基（含50 mg/L Amp和50 mg/L Kana）中, 37摇菌至A600=0.60.8。以1100的比例将菌液接种于5 mL LB培养基中, 37摇菌至A600=0.60.8时加入终

19、浓度为0.5、 0.75、 1 mmol/L的 IPTG, 于25、 30和37在 0、 2、 4、 6、 8 h分别进行诱导表达。离心收集菌体后以冷PBS重悬, 直接进行SDS?PAGE分析, 考马斯亮蓝R250染色显示蛋白条带。取最高蛋白表达量的菌液1 mL离心, 10000 g, 2 min,    弃上清液, 以无菌PBS 50 L重悬沉淀细菌, 超声裂解细菌, 再次离心。分别取上清、 沉淀10 L行SDS?PAGE检测, 以明确目的蛋白在宿主菌中的表达形式。用SDS?PAGE胶分离蛋白后, 将分离胶中的蛋白经电转印至PVDF膜上（恒压100V, 4, 1

20、.5 h）, 用50 g/L脱脂奶粉封闭电转后PVDF膜, 室温过夜, 按12000的比例, 用50 g/L的脱脂牛奶稀释抗人GITR的mAb, 4孵育过夜, 洗涤, 按110000的比例, 用50 g/L的脱脂牛奶稀释HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体, 室温孵育1 h后, 再次TBS/T洗涤, 最后加ECL发光底物, 室温孵育5 min后, 曝光洗片观察结果。 1.2.4  GITRaa27-165蛋白的纯化  将已检测证实有GITRaa27-165蛋白表达的菌液300 mL, 8000 g, 4离心10 min, 弃上清后, 按（菌重g/缓冲液体积mL） 110比例向沉淀

21、中加入溶菌缓冲液, 重悬细菌, 加入溶菌酶1 g/L, 混匀后冰浴30 min, 冰浴过程当中超声裂解细菌（加入蛋白酶抑制剂1 mmol/L PMSF）, 4, 10000g离心20min, 弃沉淀, 取上清过Profinity IMAC Ni?Charged Resin亲和层析柱纯化蛋白。SDS?PAGE检测纯化后蛋白纯度, Bradford法测定纯化蛋白的浓度。 1.2.5  抗GITRaa27-165 pAb的制备  将弗氏完全佐剂与纯化后GITRaa27-165（400 mg/L）按11的体积比例充分研磨, 制备成油包水乳化剂, 于第1、 7天免疫家兔, 第14、

22、16、 18天经兔耳静脉注射蛋白原液, 剂量分别为0.1、 0.3、 0.5 mL, 末次免疫后7 d经颈动脉放血, 取血清-70保存。    1.2.6  抗GITRaa27-165 pAb的纯化和鉴定  以Protein A Sepharose柱纯化抗GITRaa27-165 IgG, 以菌体抗原吸附去除交叉反应性抗体。用纯化后GITRaa27-165融合蛋白包被ELISA反应孔, 以免疫前兔血清作为阴性对照, 纯化后抗GITRaa27-165 pAb倍比稀释后, 通过间接ELISA法检测抗体效价。将纯化后的GITRaa27-16

23、5融合蛋白进行SDS?PAGE, 以兔源pAb（15000稀释）作为一抗, 以HRP标记山羊抗兔IgG作为二抗进行Western blot检测。2  结果 2.1  GITRaa27-165基因扩增结果  以pGEM T?GITR质粒为模板, 扩增GITR胞外段序列, 结果条带为429 bp, 与预期大小相符（图1）。 图1  GITRaa27-165基因的PCR扩增结果（略） Fig 1  The product of GITRaa27-165 amplified by PCR 1: DNA marker DL 2000; 2: GITRaa

24、27-165 gene. 2.2  GITRaa27-165基因表达载体的鉴定  将GITRaa27-165亚克隆到原核表达载体pQE30多克隆位点中, 重组克隆经酶切及PCR鉴定, 目的片段大小与预期相符（图2）。测序结果显示目标序列与GenBank（序列号为AY358877）相应序列完全相符（结果未显示）, 证实表达载体构建成功, 命名为pQE30?GITRaa27-165。 图2  pQE30?GITRaa27-165表达质粒的鉴定（略） Fig 2  Identification of expression plasmid?pQE30?GITRa

25、a27-165 1: The product from pQE30?GITRaa27-165 amplified by PCR; 2: pQE30?GITRaa27-165 digested by BamH  I and Hind ; 3: pQE30 digested by BamH I and Hind ; 4: DNA marker DL 15000. 2.3  GITRaa27-165融合蛋白的诱导表达及Western blot 鉴定  pQE30?GITRaa27-165阳性菌株经IPTG诱导后收集细菌, SDS?PAGE电泳显示: 在30、 0.5 m

26、mol/L IPTG诱导6 h条件下, 融合蛋白表达达到高峰, 蛋白条带位于约15600 bp处（与预期相符）, 用抗GITR mAb进行Western blot鉴定, 证实该蛋白条带为GITRaa27-165融合蛋白。该重组蛋白主要以包涵体形式存在, 用Profinity IMAC Ni?Charged Resin柱进行纯化及复性后, 蛋白浓度为400 mg/L, 纯度扫描证实蛋白纯度在90%以上(图3)。 图3  GITRaa27-165融合蛋白在E.coli M15中的表达、 纯化及鉴定（略） Fig 3  Expression, purification and i

27、dentification of GITRaa27-165 fusion protein in E.coli M15    1: pQE30?M15 before IPTG induction; 2: pQE30?M15 after IPTG induction 6 h; 3: The supernatant of induced pQE30?GITRaa27-165?M15 after transonogram; 4: The precipitation of induced pQE30? GITRaa27-165?M15 after transono

28、gram; 5: Protein marker; 6: Identification of GITRaa27-165 fusion protein by Western blot. 2.4  抗GITRaa27-165 pAb的鉴定  家兔在免疫过程中状态良好,   经颈静脉放血获取血清量约20 mL, 经过柱纯化、 交叉吸附处理后获得pAb。根据临界值为阴性对照A值的2.1倍进行判断, 抗GITRaa27-165 pAb的ELISA效价为11.6×105。pAb以15000稀释后进行反应, ECL显色后条带单一, 与PAGE胶考马斯亮兰染色结

29、果, 以及mAb Western blot结果比对, 位置相符（图4）。 图4  抗GITRaa27-165 pAb 的Western blot鉴定（略） Fig 4  Identification of anti?GITRaa27-165 pAb by Western blot 1: GITRaa27-165 fusion protein after purification; 2: Protein marker; 3: Identification of anti?GITRaa27-165 pAb by Western blot; 4: The result of We

30、stern blot using anti?GITR mAb. 3  讨论    目前GITR被认为是Treg细胞的一种表面标志物8, GITR低水平表达在鼠和人类的静息期T细胞上, 经刺激活化后,  表达增高, 同时GITR组成性高表达于Treg细胞膜表面, 经活化后表达进一步上调9。 Treg细胞是机体的一种重要调节细胞, 参与了机体的众多生理病理过程, 最近有关Treg细胞的功能研究已经成为免疫领域的一个热点10。对于GITR的研究, 主要集中于GITR在GITRL或抗GITR的抗体作用下, 其胞内段活化向T细胞传递信号, 通过对T细胞功

31、能的调控进而调节免疫系统各方面的表现。目前针对小鼠GITR的研究初步认定, GITR信号通路活化后, 可以通过抑制Treg细胞的功能和直接发挥共刺激作用, 促进效应性T细胞的增殖, 同时, GITR分子参与调控细胞凋亡。然而在最近的研究中, 发现尽管在人Treg细胞表面GITR也有高水平表达, 可是当以抗人GITR mAb或以重组人GITRL蛋白触发GITR信号时, Treg的抑制活性并未受到干扰6; 此外, Choi的研究团队发现在GITR?GITRL相互作用之后, GITR同样可以激活GITRL, 通过GITRL的胞质区传递信号11。这些实验现象给我们提出了新的问题, 因此对人类不同亚型T

32、细胞表面GITR分子作用的研究, 将具有更重要的意义, 此外, 当GITR/GITRL这对信号分子相互作用时, 哪一个分子的信号转导途径占有优势的问题也有待解决。        为了更深入的探索GITR?GITRL信号机制, 本实验中通过构建GITRaa27-165原核表达载体获得GITRaa27-165融合蛋白, 进一步用重组人GITRaa27-165蛋白作为免疫原, 采用经典的免疫方法获得了高效价兔源pAb, 并利用Protein A sepharose柱以及交叉吸附的方法提纯抗体, 排除可能存在的异嗜性抗原的影响。通过

33、 ELISA、 Western blot证实了此pAb效价高、 特异性好。    本实验中为深入研究GITR/GITRL的分子间作用机制以及其他可能与GITR相关的分子作用奠定了基础, 并且, 所制备pAb可初步用于检测人体内GITR在各组织器官、 细胞的分布状况, 判断病理情况下（如自身免疫病、 肿瘤、 炎症）的GITR的表达变化, 将对探讨GITR/GITRL、 甚至Treg细胞在发病机制中所起的作用具有重要意义。 【参考文献】  1 Nocentini G, Giunchi L, Ronchetti S, et al. A new member o

34、f the tumor necrosis factor/nerve growth factor receptor family inhibits T cell receptor induced apoptosisJ. PNAS USA, 1997, 94(12): 6216-6221.2 Kwon B, Yu KY, Ni J, et al. Identification of a novel activation?inducible protein of the tumor necrosis factor receptor superfamily and its ligandJ. J Biol Chem, 1999, 274(10): 6056-6061.3 Kanamaru F, Youngnak P, Hashiguchi M, et al. Co?stimulation via glucocorticoid?induced TNF receptor in both conventional and CD25+regulatory CD4+T cellsJ. J Immunol, 2004, 172(12): 7306-7314.4 Nocentini G, Nocentini S, Cuzzocrea S, et al. GITR/GITRL: More than