大鼠透明质酸合成酶3基因真核表达载体的构建及趋化作用研究

1、大鼠透明质酸合成酶3基因真核表达载体的构建及趋化作用研究【摘要】 目的: 构建透明质酸合成酶3（hyaluronan synthase3）真核表达载体, 转染真核细胞并检测重组蛋白酶活性。方法: 提取损伤大鼠坐骨神经总RNA, RTPCR扩增HAS3编码框cDNA, 构建于真核表达载体pcDNA3.1D中, 并亚克隆到荧光载体pEGFPN1中。将构建好的质粒转染大鼠施旺细胞RSC96, 检测HAS3的表达及酶活性。研究转染细胞培养上清对巨噬细胞的趋化作用。结果: HAS3真核表达载体pcDNA3.1DHAS3及pEGFPHAS3测序结果显示片段插入正确, 序列与GenBank公布数据一致, 转

2、染RSC96细胞并检测到重组蛋白的表达和酶活性, 过表达HAS3细胞的培养上清对巨噬细胞的趋化作用显著高于未转染细胞上清。结论: 成功地构建HAS3真核表达载体且真核表达的重组HAS3具有合成HA活性, HAS3过表达培养上清能趋化巨噬细胞, 在体内可能参与到炎症反应中。 【关键词】 透明质酸合成酶 载体构建 真核表达 趋化透明质酸（hyaluronic acid, HA）是由葡萄糖醛酸及乙酰氨基葡萄糖二糖单位重复排列构成的不典型的氨基聚糖, 广泛的分布于各种结缔组织、 皮肤、 软骨、 滑液中。研究证明HA在体内不仅仅是作为细胞外基质参与到组织的结构组成上, 它还是一个重要的细胞外信号分子,

3、在细胞迁移、 肿瘤、 创伤修复等方面起重要作用。HA在体内由透明质酸合成酶（HAS）合成。Itano等1于1996年从1株突变的小鼠乳腺癌细胞中第1次克隆出哺乳动物HAS, 并被命名为mmHAS1。Spicer等2随后从小鼠胚胎中克隆出第2个家族成员mmHAS2。1年后该实验室又成功克隆出HAS家族第3个成员HAS33。目前普遍认为, HAS1与HAS2催化合成大的相对分子质量（Mr）HA（HMWHA）, 其中HAS1在整个生命过程中都有表达, 但催化效率不高; HAS2在胚胎发育时表达显著。HAS3合成小Mr HA（LMWHA）, 是在成年体内最为活跃, 参与了多种生理、 病理过程。为研究H

4、AS3及LMWHA的功能及其作用机制, 我们构建了大鼠HAS3真核表达载体, 通过真核表达中检测酶活性, 并进一步发现其对巨噬细胞有趋化作用, 为深入研究打下了基础。1 材料和方法1.1 材料 SD大鼠（雄性, 180200 g）购自广州中医药大学实验动物中心; RSC96细胞来源于ATCC, 购自院上海细胞库; TOP10菌种、 pcDNA3.1D、 pEGFPN1质粒为本实验室保存; 各种内切酶及T4连接酶购自TaKaRa公司; KOD Plus 高保真酶、 ReverTra Ace逆转录试剂盒购自ToYoBo公司; TRIzol、 Lipofectamine2000购自Invitroge

5、n公司; DMEM、 胎牛血清购自 Gibco公司; 质粒回收及DNA纯化试剂盒购自OMEGA公司; DNA合成及测序由英骏广州公司完成。其他化学试剂均为分析纯。1.2 方法1.2.1 大鼠HAS3全长cDNA的克隆及载体构建 根据GenBank公布的大鼠HAS3 mRNA序列, 通过序列中本身含有的Kpn酶切位点将全长ORF分5端和3端两段进行扩增, 参照pcDNA3.1D多克隆位点的酶切位点, 共设计两对扩增引物。5端扩增上游引物为5GTCAAGCTTCACCATGCCGGTGCAGCTGACTAC3, 含有Hind 酶切位点, 下游引物为5CTTCTGATGGTACCAGTCCTC3,

6、含有Kpn酶切位点。3端扩增上游引物为5GGAGGACTGGTACCATCAGAAG3, 含有Kpn酶切位点, 下游引物为5GTCCTCGAGACCTCAGCAAAAGCCAGGC3, 含有Xho酶切位点。用TRIzol提取CCI大鼠损伤神经总RNA, 逆转录合成cDNA第1链, 用作PCR的模板。首先用3端片段的引物扩增, Tm=60, 共进行35个循环, 切胶回收。用Kpn和Xho双酶切PCR产物和pcDNA3.1D质粒4 h, 回收酶切产物, 将PCR酶切产物和酶切质粒按照101混合, 16连接过夜, 转化TOP10大肠杆菌, 菌落PCR鉴定阳性克隆, 提取重组质粒pcDNA3.1DHA

7、S3f3, 酶切鉴定, 测序。用同样方法扩增HAS3 5端片段, 插入到pcDNA3.1DHAS3f3质粒中, 构建pcDNA3.1DHAS3重组质粒并鉴定。 用Hind 和Sac 双酶切质粒pEGFPN1, 回收, 同样方法酶切pcDNA3.1DHAS3, 回收1 700 bp左右片段, 将该回收片段与pEGFPN1酶切产物101混合, 16连接过夜, 转化TOP10大肠杆菌, 菌落PCR鉴定阳性克隆, 提取重组质粒pEGFPHAS3, 酶切鉴定。1.2.2 HAS3及HAS3GFP融合蛋白的真核表达 RSC96细胞培养于含有100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培养液中, 于37、 50

8、mL/L CO2培养箱中培养。于转染前24 h按照1108个/L数量接种到24孔板中, 转染前换成无双抗的100 mL/L胎牛血清DMEM培养液。转染方法按照lipofectamine 2000说明书进行。转染6 h后, 换新鲜100 mL/L胎牛血清 DMEM高糖培养液继续培养至48 h。收集细胞, TRIzol提取总RNA和总蛋白, 逆转录合成cDNA第1链, 用作PCR模板。根据HAS3 ORF序列, 设计检测用引物, 上游引物为5TGGCTTCTTTGTGTGGCGTAC3下游引物为5TGTATGACTGTGGCGATGAGG3, 片段大小739 bp。用抗his抗体检测总蛋白中HAS

9、3的表达。荧光显微镜下观察GFP融合蛋白表达情况。1.2.3 巨噬细胞趋化实验 取成年SD大鼠肺, 用PBS灌洗两肺。灌洗液在4、 1 000 r/min下离心10 min, 用PBS洗涤细胞团, 重悬于100 mL/L胎牛血清DMEM高糖培养液中, 调整细胞密度至11010个/L。趋化实验采用transwell小室, 下室放入RSC96细胞培养上清。取150 L巨噬细胞悬液滴于膜上, 37培养90 min, 用棉花轻擦膜上表面, 将膜反向放入另一培养板中, 甲醇固定10 min后, 用吉姆萨染液染色1 h, 流水洗涤, 晾干。镜下观察膜上染色细胞个数。2 结果2.1 表达载体的构建 pcDN

10、A3.1DHAS3和pEGFPHAS3重组质粒经酶切鉴定与理论大小相符（图1）, 测序结果与GenBank中的序列完全一致, 说明目的片段已经正确插入到载体上。图1 重组载体pcDNA3.1DHAS3及pEGFPHAS3的酶切鉴定（略）Fig 1 Restrictive enzyme digestion analysis of recombinant expression vector pcDNA3.1DHAS3 and pEGFPHAS3M: DL 15 000 DNA marker; 1: pcDNA3.1D; 2: pcDNA3.1H3; 3: pEGFPN1; 4: pEGFPH3.1

11、 2.2 HAS3His与HAS3GFP融合蛋白的真核表达 用pcDNA3.1DHAS3和pEGFPHAS3重组质粒转染RSC96细胞48 h后, 分别通过RTPCR, Western blot和荧光显微镜观察重组蛋白的表达情况（图2、 3）。RTPCR结果显示转染pcDNA3.1DHAS3的细胞有大量HAS3 mRNA的表达, 而转染pcDNA3.1D空质粒的对照组未检测出HAS3mRNA的表达。Western blot结果也显示转染pcDNA3.1DHAS3重组质粒的细胞能检出HisHAS3的表达, 而对照组未检出。转染pEGFPHAS3重组质粒48 h后, 荧光观测重组蛋白的表达情况,

12、可观察到带有明显绿色荧光的细胞, 并且荧光主要分布于细胞膜上。转染pEGFPN1的对照组也可观察到细胞内的绿色荧光, 但荧光分布于整个细胞基质, 说明HAS3GFP融合蛋白能够定位于细胞膜上, 从而可能具备酶活性。2.3 巨噬细胞趋化实验 检测了过表达HAS3细胞的培养上清对巨噬细胞的趋化活性（图4）。结果显示实验组处理的巨噬细胞的穿膜能力高于对照组, 暗示LWAHA可能参与到炎症反应的过程中。图2 HAS3His融合蛋白在RSC96细胞中的表达（略）Fig 2 Expression of HAS3His fusion protein in RSC96 cellsA: RTPCR analys

13、is of mRNA level of HAS3; B: Western blot analysis of HAS3 expression. WT: Wild type; 1: pcDNA3.1; 2: pcDNA3.1DHAS3.图3 HAS3GFP融合蛋白在RSC96细胞中的表达（略）Fig 3 Expression of HAS3GFP fusion protein in RSC96 cellsA: pEGFPN1; B: pEGFPHAS3.图4 HAS3过表达培养上清对巨噬细胞穿膜能力的影响（略）Fig 4 Effects of condition medium of HAS3 ov

14、erexpression RSC96 cells on chemotaxis of macrophages3 讨论 HA的作用与其 Mr的大小有关。Mr在200 000左右的LMWHA能够激活核转录因子NFB, Mr大于6106的HMWHA却起抑制作用。 Fieber等4的研究也发现, LMWHA能够促进MEFs和3LL细胞MMP13和MMP9的表达, 而HMWHA却没有明显作用。此外, HAS3和LMWHA还参与到损伤后炎症过程中。Bai等5用HAS3敲除的小鼠研究了小Mr HA在肺损伤中的作用, 发现野生型小鼠在损伤后有明显的白细胞浸润, MIP2和HAS3的表达提高, 而HAS3敲除鼠没

15、有这种表现, 进一步证明了HAS3及LMWHA在肺损伤后的炎症反应中起着关键作用。目前的研究表明, LMWHA似乎更多的参与到损伤及损伤后的炎症反应中, 其机制需要进一步研究。 我们在神经损伤及神经源性慢性疼痛的研究中也发现, HA的积累和HAS表达的上调可能参与到神经损伤和疼痛发生中, 因此克隆了大鼠HAS3全长, 进一步研究LMWHA在损伤和炎症中的作用机制。根据已有的研究结果, 我们在损伤神经中检测到HAS3表达, 从cDNA中克隆HAS3全长。最初直接通过PCR扩增HAS3 全长未能扩出条带, 根据进一步分析发现, HAS3 ORF在HAS3 cDNA的位置为1721836, 考虑到逆

16、转录过程中, cDNA可能形成的结构、 5端的完整性以及长片段高保真酶反应效率, 我们利用HAS3 ORF中的Kpn 酶切位点将HAS3全长分为两段分别扩增, 连接到pcDNA3.1D载体上。结果表明, 相同条件下3端片段扩增后产物浓度明显大于5端片段, 说明在最初进行全长扩增时确实在5端位置遇到障碍, 导致无法直接扩出全长。我们先后将两片段连接到载体后测序表明片段插入正确, 序列与GenBank公布数据一致。我们用pcDNA3.1DHA3转染RSC96细胞, 48 h后通过RTPCR和Western blot检测HAS3表达, 结果野生型和转染空载体的细胞均未检测出HAS3的表达, 而转染p

17、cDNA3.1DHAS3的细胞检测出明显的表达。然后我们通过转染pEGFPHAS3检测GFPHAS3融合蛋白的表达, 对重组HAS3进行定位。与转染pEGFPN1的空载体相比GFPHAS3融合蛋白明显多分布与细胞膜上。 在随后的实验中, 我们发现过表达HAS3细胞的培养上清对巨噬细胞具有明显的趋化作用, 也表明在机体损伤后HAS3表达和LMWHA合成的增加可能参与到炎症反应中。从目前报道看, HA对细胞的趋化过程至少有两种可能的途径。一是细胞对HA分子本身的趋向性, Tzircotis等6报道部分细胞如MDAMB468和MDAMB231乳腺癌细胞能够在CD44介导下从低浓度HA环境趋向高浓度H

18、A环境, 而NIH3T3细胞则没有这种行为。另一方面, LMWHA能够诱导一些细胞因子的表达, 如IL8, MCP, MIP2等, 趋化炎症细胞向炎症位点浸润。 总之, 研究HAS的表达调控、 活性变化对于阐明HA合成机制和功能至关重要。我们克隆出大鼠HAS3基因, 并通过真核表达检测了其活性, 有利于深入研究生理或病理过程中HAS3及HA调控的功能机制。【】 1 Itano N, Kimata K. Expression cloning and molecular characterization of HAS protein, a eukaryotic hyaluronan synthaseJ. J Biol Chem, 1996, 271(17): 9875-9878.2 Spicer AP, Augustine ML, McDonald JA. Molecular cloning and characterization of a putative mouse hyaluronan synthaseJ. J Biol Chem, 1996, 271(38): 23400-2