抗人CD25分子单链抗体基因的构建、 表达及初步鉴定

1、抗人CD25分子单链抗体基因的构建、 表达及初步鉴定摘nbsp;要nbsp;nbsp;目的:nbsp;构建和表达抗人CD25分子单链抗体（scFv）蛋白,nbsp;nbsp;并测定其生物学活性。方法:nbsp;用RTPCR方法从能分泌特异性抗CD25单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基 Construction, expression and identification of a single chain antibody variable (scFv) against human CD25 molecule SHEN Tao, ZHANG Aihua*, BI Lan

2、, SHI Liangru Department of Microbiology and Immunology, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035; Department of Immunology and Monoclonal Antibodies R&D Laboratory, Wuhan Biological Products Institute, Wuhan 430060, China Abstract AIM: To construct and express a single chain fragment variable (scFv)

3、 fragment against human CD25 molecule and identify its bioactivity. METHODS: VH and VL genes of antimurine CD25 monoclonal antibody were cloned by RTPCR from hybridoma cell WuTac secreting antiCD25 mAb. scFv gene was spliced by sequence overlap extending (SOE) PCR, and then it was ligated into pMD18

4、T vector to be identified by endonuclease digestion, PCR and sequencing. scFv gene was cloned into pBAD/gIIIA expression vector and transformed into TOP10 E.coli. After positive clones were induced by Larabinose for 4 hours, the purity of protein was detected by SDSPAGE and its bioactivity was ident

5、ified by competitive inhibition ELISA test. RESULTS: scFv genes of VL(GGGGSGGGGSSGGGS)VH was constructed successfully. The VH chain consisted of 351 bp and encoded 117 amino acids, which belonged to heavy chain subgroup III (C) of mouse immunoglobulin variable region. The VL chain consisted of 318 b

6、p and encoded 106 amino acids, which belonged to light chain subgroup IV of mouse immunoglobulin variable region. The scFv antibody expressed by TOP10 fused with 6His and Cmyc tag protein and the relative molecular mass of fusion protein was about 31 000. Competitive inhibition ELISA test indicated

7、the scFv antibody had specific activity. CONCLUSION: The expressed product of the singlechain antibody shows some specific binding capacity, which provides a basis for the clinical application of antiCD25 singlechain antibody. KeywordsCD25; scFv; protein expression; ELISA 摘 要 目的: 构建和表达抗人CD25分子单链抗体（s

8、cFv）蛋白, 并测定其生物学活性。方法: 用RTPCR方法从能分泌特异性抗CD25单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因。用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起, 构建抗CD25分子scFv的基因。将scFv基因克隆至pMD18T, 用限制性内切酶切以及测序鉴定。将scFv 基因连接到pBAD/gA表达载体, 转化Top10表达菌。阳性克隆用左旋阿拉伯糖诱导4 h, SDSPAGE电泳检测蛋白纯度, 竞争抑制ELISA实验检测其活性。结果: scFv基因长度约为700 bp。通过DNA序列测定和分析, 构建出VL(GGGGS)3VH（但其中349位G突变为A, 使L

9、inker其中一位GlySer）。其VH隶属于小鼠Ig重链可变区（C）亚类, 全长351 bp, 可编码117个氨基酸; 其VL隶属于小鼠Ig轻链可变区亚类, 全长318 bp, 可编码106个氨基酸。TOP10中表达的scFv抗体加上同时融合表达的两个标签6His和Cmyc Mr约为31 000, 结果符合scFv的Mr。竞争抑制细胞ELISA实验显示表达的scFv具有活性。结论: 此scFv基因的表达产物具有一定的特异结合活性。为抗CD25 scFv的临床应用打下了基础。 关键词CD25; scFv; 蛋白表达; ELISA CD25是白介素2受体（IL2R）的亚单位1。抗CD25抗体能抑

10、制IL2与受体结合, 阻止依赖IL2的生物反应, 抑制其促使T淋巴细胞进入有丝分裂期进行克隆扩增的作用, 有明显的免疫抑制和调节作用, 在器官移植和肿瘤治疗中应用广泛2。其鼠源性单克隆抗体（mAb）已在临床上取得了良好的疗效, 但由于其相对分子质量（Mr）较大及其鼠源性, 在临床应用被大大限制。本研究中应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术, 直接从一株分泌抗CD25 mAb的杂交瘤细胞WuTac中扩增出轻链及重链可变区的基因序列并采用拼接重叠延伸PCR (splicing by overlap extension PCR)即SOEPCR的方法构建了WuTacscFv基因, 并进行了序列测定

11、和分析, 得到了VL(GGGGS)3VH(其中349位G突变为A, 使Linker其中一位GlySer)的scFv基因。将阳性重组质粒转化大肠杆菌进行分泌性表达, 获得了具有一定活性的scFv蛋白。 1 材料和方法 1.1 材料 分泌抗人CD25 mAb（IgG1）的杂交瘤细胞系WuTac3, 本室保存。为免疫球蛋白亚型。E.coli XL1Blue购自Promega公司; E.coli TOP10购自Invitrogen公司; 克隆载体pMD18T系统购自TAKARA公司; 表达载体pBAD/gIIIA购自Invitrogen公司。Trizol Reagent购自Invitrogen公司;

12、SuperScriptTM Firststrand synthesis system for RTPCR Kit购自GIBCO BRL公司; Taq DNA聚合酶购自MBI公司; T4 DNA连接酶和购限制性内切酶购自Promega公司; 200 g/L左旋阿拉伯糖(Larabinose) 购于Invitrogen公司; 鼠抗His抗体购于Pharmacia biotech公司; 羊抗鼠IgGHRP购于Sigma公司。 1.2 方法 1.2.1 VH和VL引物设计 参照文献4和Blast数据库的统计资料, 以及所选Linker (GGGGS)3的核苷酸编码序列, 设计并合成4条寡聚核苷酸引物。

13、在VL和VH引物中分别引入Nco I和Xba I限制性内切酶的识别序列, 其中R=A/G, M=A/C, S=C/G, W=A/T, Y=C/T, K=G/T。VLback: 5CAGATGCCATGGCGATTGTKCTSACYCARTCTCCA3; VLforward: 5CGAGCCGCCACCGCCCGAGCCACCGCCTCCTTTCAGCTCCAGCTT3; VHback: 5GGCGGTGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCTCTGTCCAGCTCCAGCAG3; VHforward: 5GACGGT TCTAGATGGGAGACGGTGACTGAGGTT3。 1.2.2 V

14、H和VL的提取及scFv基因的构建 复苏WuTac细胞, 参照Trizol Reagent kit的说明书, 一步法提取WuTac细胞总mRNA。参照SuperScriptTM RTPCR逆转录试剂盒说明书, 逆转录获得cDNA, 再以cDNA为模板, PCR扩增出抗CD25 mAb的轻重链基因。采用重叠延伸拼接法(splicing by overlapping extension, SOE) 将轻重链基因连接成单链基因, 具体过程如下: 首先将纯化后的轻重链基因混匀, 在无外加引物的情况下, 互为引物和模板, PCR反应(94 30 s, 58 30 s, 72 60 s)扩增7个循环, 随

15、后在反应体系中补加VLback和VHforward, 同样的PCR反应条件扩增30个循环。最终将所得PCR产物与克隆载体pMD18T连接后酶切测序鉴定。 1.2.3 scFv的表达 将重组克隆载体和原核表达载体pBAD/gIIIA用Nco I和Xba I分别双酶切后连接成重组表达载体。参照表达载体说明书, 以2YT为培养基, 用不同浓度的Larabinose (20%0.002%) 在37诱导表达, 根据产物产量确定最佳浓度为20 g/L, 诱导时间为4 h。 1.2.4 细胞ELISA活性检测 制备外周血单个核细胞(PBMC)悬液, 用尼龙棉柱法去除B细胞, 用无血清的RPMI1640洗涤3

16、次后调整密度为1109/L, 96孔细胞反应板中加入含20 mL/L FCS的RPMI1640 20 L, PHA（250 g/L） 20 L, 然后每孔加入上述细胞悬液100 L, 置于37, 50 mL/L CO2条件培养48 h; 将培养细胞稀释至5107/L, 接种至96孔细胞培养板, 37培养24 h后弃去培养液, 冷丙酮固定10 min, 弃去丙酮; 每孔加阻断剂100 L (10 mL PBS+100 L 300 mL/L H2O2), 室温保持30 min, PBS洗涤3次, 每次5 min; 将上述纯化的鼠源scFv分泌产物作5倍梯度稀释, 空表达载体转化的E.coli. p

17、BAD/gIIIA TOP10经上述同样的诱导表达产物作阴性对照; 加新鲜配制的封闭液200 L/孔, 37, 2 h; PBS洗涤3次, 每次5 min; 加入已稀释的scFv上清100 L/孔, 混匀, 37, 2 h; 用PBST和PBS先后各洗3次, 加一抗(anti6His antibody ) (用新鲜配制的封闭液稀释至15 000) 100 L/孔, 37, 2 h; 用PBST和PBS先后各洗3次, 每次5 min; 加二抗(羊抗鼠IgGHRP) (用新鲜配制的封闭液稀释至11 000) 100 L/孔, 37, 2 h; 用PBST和PBS先后各洗3次, 加新鲜配制的底物H2

18、O2/OPD, 室温避光30 min; 加2 mol/L H2SO4终止反应后测定A492值。 1.2.5 竞争抑制细胞ELISA 鼠源scFv分泌产物作5倍梯度稀释, 100 L/孔。同时加WuTac杂交瘤细胞培养小鼠腹水3倍稀释液100 L/孔。空表达载体转化的E.coli. pBAD/gIIIATOP10经上述同样的诱导表达产物作阴性对照; 加二抗(羊抗鼠IgGHRP) (用新鲜配制的封闭液稀释至11 000) 100 L/孔, 其余步骤同同1.2.4。 2 结果 2.1 抗CD25 scFv基因的构建和阳性表达载体的鉴定 从WuTac杂交瘤细胞中提取的总RNA经RTPCR的cDNA为模

19、板扩增出轻重链基因, 再利用设计在引物两侧的重叠片段进行SOEPCR反应, 获得Mr长约700 bp左右的基因片段。将其与pMD18T连接后, 转化E.coli XL1Blue, PCR鉴定后, 再双酶切和T4酶连接, 将scFv片段连接到表达载体pBAD/g/A上, 转化后Nco I和Xba I双酶切鉴定。如图1所示, 其中1#、 2#、 6#克隆含有目的片段。 图1 WuTacscFvpBAD/gIII/A表达载体酶切分析（略） Fig 1 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmids 1: DNA marker

20、; 2-4: Recombinant plasmid 1#, 2# and 3#; 5: DNA marker; 6-8: Recombinant plasmid 4#, 5# and 6#; 9: DNA marker. 2.2 抗CD25 scFv基因序列分析和鉴定 将上述1#、 2#、 6#克隆序列测定, 结果显示1#、 2#克隆序列为阳性克隆。但其linker为GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlyGlySer。原因是由于其中349位G突变为A, 使Linker其中第11位GlySer。但中间无终止密码出现。将此种scFv称为抗CD25scFv。

21、1#、 2#克隆序列完全一致, 经与BLAST和Kabat基因数据库查询确定其VH隶属于小鼠Ig重链可变区（C）亚类, 全长351 bp, 可编码117个氨基酸; 其VL隶属于小鼠Ig轻链可变区亚类, 全长318 bp, 可编码106个氨基酸。 2.3 抗CD25 scFv基因表达分析 将1#克隆阳性转化菌进行诱导表达, SDSPAGE及Western blot检测表达的融合蛋白。Mr为31 000左右。结果见图2、 3。 图2 阿拉伯糖诱导表达产物的SDSPAGE结果（略） Fig 2 The SDSPAGE results of expressing products induced by

22、 Larabinose 1: Protein marker; 2, 4: Positive E.coli TOP10 induced by Larabinose respectively; 3: Negative E.coli TOP10 induced by Larabinose; 5: Positive E.coli TOP 10 not induced by Larabinose. 图3 重组蛋白的Western blot分析（略） Fig 3 Western blot analysis of recombinant protein 1: Prestained marker; 2: Ce

23、ll control; 3, 4; Positive E.coli TOP10 induced by Larabinose respectively. 2.4 抗CD25 scFv基因表达产物特异性检测 细胞ELISA检测表达产物与丝裂原活化的T细胞的结合, 测定A492。空表达载体转化的E.coli. pBAD/gIIIATOP10经上述同样的诱导表达的产物作阴性对照。抗CD25scFv对WuTac的竞争抑制分析结果表明 阳性转化菌上清表达产物与CD25抗原有一定的结合能力, 改造后的scFv仍保持着其亲本抗体的特异性和结合活性（图4、 5）。 图4 鼠源性抗CD25scFv与活化T细胞结合

24、能力检测（略） Fig 4 Analysis of the binding ability between scFv and activiated T cells 图5 鼠源性抗CD25scFv对亲本抗体WuTac的竞争抑制分析（略） Fig 5 Analysis of the binding competition inhibition by the scFv and WuTac 3 讨论 IL2与IL2R相互作用是一个药物干涉达到免疫抑制很重要的靶目标1, 5。鼠源抗Tac及其他IL2R抗体能抑制IL2与受体的结合, 阻止依赖IL2的生物反应。在人类能预防肾脏、 心脏、 皮肤、 胰腺同种异

25、体移植后的急性排斥反应, 延长器官移植后的生存时间, 甚至还有抑制迟发性超敏反应的作用。但鼠源性mAb 对人体来说是一种异种蛋白, 在人体内多次应用后, 可诱导产生人抗鼠抗体（HAMA）和过敏反应等副作用, 并影响其治疗效果, 从而阻碍了其应用范围, 使其应用受到限制。本实验中, 一方面由于时间和条件的限制, 没有对表达产物进行亲和层析纯化(利用6His标签可与镍离子结合), 同时也考虑到在纯化的过程中会丢失大量的目的蛋白, 对其活性也会有不同程度的影响。另一方面由于缺乏纯化的CD25抗原, 对scFv的活性检测增加了难度。利用活化的T细胞作为抗原进行细胞ELISA能在一定程度上证明所分泌的抗体具有与CD25抗原结合的活性。我们利用一抗(鼠抗6His)和二抗(羊抗鼠IgGHRP)做间接细胞ELISA对分泌产物的活性进行了初步分析, 为进一步对scFv的大量表达和大量提取、 纯化、 活性鉴定以及免疫毒素的构建打下了良好的基础。 参考文献: 1 Baan CC, van der Mast B