抗B-CLLIdx抗CD3双特异性抗体的制备及其特性研究

1、抗B-CLLIdx抗CD3双特异性抗体的制备及其特性研究?摘 要 应用无筛选标记细胞株杂交瘤.杂交瘤细胞直接融合法制备了2株分泌抗慢性B淋巴细胞白血病（B-CLL）Idx抗CD3双特异性抗体（BsAb）的四价体瘤细胞株。采用间接ELISA试验与间接免疫荧光试验证明了该BsAb能分别与B-CLL患者血清及带CD3标记的细胞特异性结合，经细胞结合试验证明该BsAb同时具备与Id及CD3两种抗原结合能力，经酶桥联法证明该BsAb亚类为IgG1IgG2a，用MTT法证实BsAb能诱导T细胞活化增殖。关键词 白血病，淋巴细胞，双特异性抗体，四价体瘤中号 R733.72，R392.11 PREPARATI

2、ON AND CHARACTERISTICS OF MONOCLONAL ANTI-IDIOTYPIC AND ANTI-CD3 BISPECIFIC ANTIBODIES TO HUMAN B CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIAYang Jing， Wang Xiaolin， Shen Guanxin，Zhu Huifen，Su Na（Department of Immunology， Tongji Medical University， Wuhan 430030）Abstract 2 quadroma cell lines secreting monoclonal a

3、nti-idiotypic（Anti-Id） and anti-CD3 bispecific antibo-dies （BsAb） to human B chronic lymphocytic leukemia （B-CLL） were obtained by using direct B cell hybridization technique of hybridoma and hybridoma lack of screening markers The specificity of BsAbs from culture supernatant or ascites was assayed

4、 by indirect ELISA， indirect IF and cell combination test The results showed that BsAbs could specifically react with homologous serum IgM from patients with B-CLL and cells carrying CD3 marker respectively， but also with Id and CD3 antigens simutaneously The BsAbs belonged to IgG1IgG2a subclass by

5、sandwich ELISA The biological characters of BsAbs were tested by MTT colorimmetry The results showed that BsAbs could induce T cell proliferation and enhance cytotoxcity of LAK cells on target cells in vitroKey words B chronic， Lymphocytic leukemia， Bispecific antibody， Quadroma抗肿瘤双特异性抗体（bispecific

6、antibody， BsAb）由于具有同时与两种不同抗原结合的双重特异性，在肿瘤靶向生物治疗中具有广阔的应用前景1，2。目前，国内有关抗B-CLL独特型与抗CD3双特异性抗体（抗白血病Idx抗CD3BsAb）的研究尚无报道。为此，我们通过无筛选标记杂交瘤细胞株直接2次融合法制备了分泌抗白血病Idx抗CD3BsAb的四价体瘤细胞株，并对其BsAb的特性、Ig亚类进行了研究。1 材料与方法1.1 材料 分泌抗人CD3McAb杂交瘤细胞株由德国埃森大学免疫所引进；分泌抗人B-CLL独特型McAb杂交瘤细胞株（SM6）由本室制备3。1.2 分泌抗白血病Idx抗CD3BsAb四价体瘤细胞株的制备 采用杂

7、交瘤.杂交瘤细胞直接融合法。按常规方法复苏并培养分泌抗CD3与SM6细胞株，分别取抗CD3杂交瘤细胞与SM6培养细胞，以11比例混合，按本室常规方法4在50PEG（分子量3350，Sigma公司产品）作用下促进细胞融合，然后用含20FCS-RPMI1640选择培养基（内含Balbc小鼠腹腔巨噬细胞1105ml作为饲养细胞）悬浮细胞。计数融合细胞并调浓度为1106ml，接种于24孔培养板中，每孔1ml，置37C 5 CO2培养箱中培养。35d换液一次，待融合细胞长至培养板孔底1323时进行抗体分泌检测，并对与CD3及白血病患者IgM均呈阳性反应的双阳性孔采用有限稀释法进行克隆化培养与再筛选。从克

8、隆板中筛选出分泌BsAb的阳性克隆，然后进行扩大培养。1.3 间接ELISA试验 用B-CLL病人粗提Ig（内含IgM）包被酶标板，然后加待测杂交瘤.杂交瘤融合细胞培养上清100l孔，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（Sigma）为第2抗体，底物显色后在490nm下测定OD值，OD值为阴性对照2倍或以上的各孔为阳性反应。1.4 间接免疫荧光试验 取杂交瘤.杂交瘤融合细胞培养上清，加入人PBMC，然后加入荧光标记的羊抗鼠抗体，洗涤未结合的荧光标记抗体，滴片，在荧光显微镜下观察阳性细胞数。1.5 结合试验鉴定BsAb的双特异性 分别取靶细胞（Daudi， HL-60细胞）与效应细胞（LAK细胞）5

9、，按11比例混合，然后加入浓缩56倍的BsAb上清100l孔，1 000rmin离心5min，置37C水浴30min，滴片观察，在显微镜下计数细胞结合率，通常以一个靶细胞上结合2个效应细胞为阳性结合细胞。细胞结合率（）(与效应细胞结合的靶细胞数)/(总细胞数)1001.6 酶桥联法鉴定BsAb的分子亚类 采用德国Boehringer公司的小鼠杂交瘤Ab亚类试剂盒对浓缩56倍的培养上清进行鉴定。1.7 BsAb的纯化 采用辛酸-硫酸铵沉淀法6，从四价体杂交瘤细胞诱生的小鼠腹水中提取BsAb。1.8 MTT法检测BsAb诱导淋巴细胞增殖效应 先用B-CLL粗提Ig包被96孔板，同时设立无Id抗原包

10、被的对照组，分别加入不同浓度的BsAb（0、1.25、2.5、5.0gml），再加入PBMC，培养66h，然后用MTT比色法测定各孔OD值。2 结果2.1 四价体杂交瘤细胞株的建立 采用无筛选标记杂交瘤细胞株直接融合克隆法，在80个单克隆孔中，获得了双抗原阳性反应孔共27株，其中经双抗体夹心法及细胞结合试验鉴定，仅有2株为真正分泌BsAb的抗IdxCD3BsAb的四价体杂交瘤细胞株，分别命名为BsId1和BsId2，阳性率为2.5。将所获分泌BsAb的四价体瘤细胞株诱生小鼠腹水并提纯BsAb，证明获得了良好的抗体分泌效果。2株BsAb四价体杂交瘤细胞经多次液氮冻存、复苏和体外培养，仍保持良好和

11、稳定的分泌BsAb的能力。2.2 BsAb特异性鉴定2.2.1 通过间接ELISA试验证实，2株四价体瘤分泌的BsAb均能与B-CLL患者粗提Ig呈阳性反应，而与正常人纯化IgM呈阴性反应。此与抗B-CLL IdMcAb相似2（见表1）。表明BsAb具有与B-CLL患者血清IgM独特型特异性结合的能力。表1 BsAb与不同来源IgM的反应性（OD）Tab 1 The reactivity of 2 BsAb with varivable IgM（OD）McAbBsId1BsId2SM6CD3PBS-BSAHomologous IgM065068038035033Normal0260320290

12、37028222 通过间接免疫荧光试验证实，2株四价体瘤分泌的BsAb能与人PBMC细胞呈阳性反应，此与抗CD3McAb相似。表明BsAb具有与带CD3抗原标记的细胞特异性结合的能力。2.2.3 经细胞结合试验表明，2株四价体瘤所分泌的BsAb均能使带有IgM Id标记的靶细胞（Daudi cell）与带有CD3标记的效应细胞有效结合，但不能使不带有IgM Id标记的靶细胞（HL-60）与效应细胞有效结合（见表2）。表明BsAb具有与IgM Id及CD3两种不同抗原同时结合的双特异性。 表2 BsAb介导的细胞结合试验（）Tab 2 The identification of 2 BsAb b

13、y cell combination test（）CellBsId1BsId2CD3SM6PBS-BSADaudiLAK43347347HL-60LAK1085 4 224 2株四价体瘤所分泌的BsAb经酶桥联法证实，其分子结构中含有IgG1亚类与IgG2亚类，已知抗CD3 McAb属IgG2亚类，抗白血病IdMcAb属IgG1亚类。表明，所获得的BsAb是由抗CD3杂交瘤与SM6杂交瘤二次融合形成的四价体瘤细胞所分泌的，其IgG亚类为IgGIgG2。2.2.5 BsAb诱导淋巴细胞增殖效应：通过MTT法测定2株四价体瘤分泌的BsAb对PBMC增殖效应发现：BsAb在有或无IgMId抗原存在时

14、，均有促进淋巴细胞增殖的趋势，在有IgMId抗原存在时，这种促增殖作用更明显，且与BsAb浓度有一定的正相关性（见1）。提示BsAb在靶向生物治疗中，具有促进淋巴细胞活化增殖作用。12株BsAb诱导淋巴细胞增殖效应Fig 1The lymphocyte proliferation induced by 2 BsAb3 讨论目前，BsAb的研究受到了广泛重视，制备BsAb的方法通常有3种，即二次杂交瘤法，化学偶联法及基因工程技术7。但化学偶联法制备BsAb产量有限，且容易导致抗体活性改变；基因工程技术制备BsAb，其技术较为复杂，也受到了一定制约；而杂交瘤技术制备BsAb产量大，生物活性高，且抗

15、体性质也较稳定。其中无筛选标记细胞株杂交瘤.杂交瘤技术二次细胞融合克隆制备BsAb，由于省去了常规二次杂交技术中诱导和建立筛选标记细胞株的过程，因而缩短了制备BsAb周期，有利于快速制备BsAb。本文通过不建立筛选标记的直接二次细胞融合技术制备了抗B-CLL Idx抗CD3BsAb，并对BsAb的特异性及亚类进行了研究，表明通过本法制备BsAb，一方面可以缩短制备BsAb的时间，另一方面可以制备出活性及稳定性良好的BsAb，为进一步研究BsAb的功能提供了物质基础。本文还研究了抗白血病IdxCD3 BsAb诱导T细胞增殖效应，显示BsAb具有促进淋巴细胞增殖效应并有一定浓度依赖性。在有Id抗原

16、存在时，这种促增殖作用更为明显。这为进一步研究BsAb的各种免疫学和生物学效应提供了理论基础与实验依据，具有重要的应用前景。国家自然科学基金资助项目（NO.39370627）第一作者：女，32岁，大专，技师作者单位：同济医科大学免疫学教研室，武汉 430030参考文献1 Weiner GJ， Kostelny SA， Hillstrom JR， et al The role of T cell activation in anti-CD3xantitumor bispecific antibody therapy J Immunol， 1994， 152：23852 楼 敏，皇莆玉珊，薜 琪，等.双特异性抗体对LAK细胞增殖和细胞毒作用影响的体外研究.中华微生物和免疫学杂志，1996，16（3）：1593 沈关心，苏 娜，孙 蓓，等.慢性淋巴细胞白血病独特型McAb的研究.中华微生物与免疫学杂志1991，10（8）：3714 沈关心，朱慧芬，王晓林，等.骨髓瘤蛋白（IgD）独特型单克隆抗体的制备.中国免疫学杂志，1990，6（3）：1385 Grimm EA，Robb RI，Roth JA，et al Lymphokine-act