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文档简介

1、中国科学院生物化学与细胞生物学研究所硕士学位论文异柠檬酸脱氢酶的结构与功能研究及MRG15和PAM14相互作用方式的研究姓名:赵景月申请学位级别:硕士专业:生物化学与分子生物学指导教师:丁建平20061001异柠檬酸脱氢酶的结构与功能研究及与程互作用方式的研究摘要异柠檬酸脱氢酶()是一大娄酶家族,该酶催化异拧檬酸氧化脱羧生成甜酮戊二酸,在生物的能建产生和生物合成代谢中越着非常重要的作用。真棱生物中以为辅酶酶霁柠檬酸髓氢酶()具有报多鬟癸黥生耪功激,但其动力学机制和活性调节机理目前还不清楚。我们以结构生物学为研究手段,结合生物化学和分子生物学的方法来嚣丹究人源细胞腰()的动力学税裁稻酒性调节祝疆

2、。已得虱该酶不两形式(瓣生型蠢突变体)及萁穗关笺台物的蛋白质晶体,通过分析已有的绐构,进行了氨基酸点突变。对应于发生可逆磷酸化调节酶活性的位点隔可以在没有底物豹条件下与辨形成氢键。对这两个位点我们设计完成了圈个突变体,分剐为、署,它们对异柠檬酸和”的值郡明显增大,而对的艇;毽几乎没裔变化,其表现出的酶活性大大降低。同时,我剥影商结合的重要位,点辑搭进行了突变。除,其他的突变体都表现出对的墨。值的变化,增大为野生型的倍到倍不等,而对异柠檬酸,豹甄蠢没蠢弱显变化。这些结繁表、”在酶催化反应中都发挥着重要的作用,僵超作用的方式又不尽相同,分剐参与底物和辅酶的结合。通过分析结构和酶学数据,我们提采用稳

3、态随机的酶促反应动力学极剁。我爨豹研究绥粟为阉磺嚣拧檬酸聪氢酶瓣缓讫祝制撼供了猿据,并帮助我们分析理解该酶的生物学功能。是组织中广泛表达的转深因子,在很多真核生物中都存在其同源物,它们共同组成了蛋白家族。在照胎发育、细胞增殖和细胞衰老过程中起鬟要馋矮。其羧基爨独立形戏一个瀑守豹结稳域,参与转录澜控中与精白和另一核蛋白的相互作嗣。在已有结构域()黼体结构的揍础上,我们采用酵母双杂交系统柬研究上瑟稳域()与豹耀豆搏爰方式,基予结麓竣谤定点突变寒寻找与结合中超作用的重要氨澄酸位点。根据二级结构预测,我们将裁成三段(、和),发现与戆稳互传矮鬣强。夔嚣我销逡葶亍萃点突变秘双突变藩与粒酵母双杂交蜜验。我们

4、的实验结果为进一步阐明和的相互作用方式提供了一魑线索。关键词:晶体结构,异柠檬酸脱氢酶,动力学机制,细胞褒纛,酵母双杂交,定点突变一,()()();,(,),(¥,),糕,”。,舛,”,孵,¥。,队,。,(,),:,:,:,;,:,:,:,;,:,;,;,;,一;,一一;,:,;,:,:,一,一,:一一乃,一一,一一一一,中科院上海生命科学研究院研究生学位论文声龋本人郑重卢明:)所至交的学位论文,是本太在导筛的指导下,独立进行研究工作所般得朗成果。除文中已经注明引用的内容或耩合作研究然旧完戚的“:作夕卜。,本论文誉謦含强俺箕德令天或囊搴已经发表或撰写遭麴箨晶残采:黯零文韵磷宠徽搬熏爰觅献的个人

5、和集体,均已在文中以明确方式栎明。)所呈交蕊学健谂文,实验结袋均由锾应的实验数据努撰遐出,实验数据真实可靠。该声髓靛法律缝蒙由零入承担。学位论文作者签名起景弼门期:薅占年弼垮门硬舞熊掌位论文版投蠖甩授投声臻本人完全了解并嗣意遵守中科晚上海生命科学研究院有关保留、使用学化论一文的规定,即;生科院裔杈保辩送交浚霓翡盈印侔和色于文棒,并键供沧文的秘一录伦索及借阅、查阕;生科院可以公确论文的全部或部分内容,可以将本学位论文岛全鄢或帮分内窖缠久毒关鼗舞蓐进行检索,鼋潋采翻彩印、:缩印或其它复溯弓保存和编本学似论文。保密的玲文盘解街后遵:于此规定作者签名:丝导签名舅籀:型:堕煎鬻彝柠檬酸的维稳尊葫研究及与

6、相互作用方式酶研究正文第一部分异柠檬酸脱氢酶的结构与功能研究一、引言。吴柠禳酸羧氢酶粒掇滋异柠檬酸脱氢酶()是一类酶家族,该类酶催化异柠檬酸氧化脱羧生成一酮戊二驻,反应的中间产物是草蹴琥珀酸,它烂一个不稳定的酮酸,当与黪续宫惹翼裁羧影成伽聚戊二酸。)()异柠檬酸脱魍酶属于大类金属离子依赖型的脱飘酶家族(),包括异丙基苹果酸脱氯酶()和苹果酸脱氯酶,它们在级痔歹上没鸯稳钕蛙,稳在三缀蘩稳上帮其毒稷瓷豹藏源毪。这类酶豹疯鞠程结构上很相似,()(),对于辩柠檬酸脱氢酶来说,其中的代表,异丙基苹果酸脱氟酶则为(),苹果酸脱氢酶为。它锯罐纯熬菠澎其畜其佼,篾荤说亲帮蠢惫驭镬上越氢,交羟麓爻袋菝基,然后从

7、上脱去羧基()。异柠檬羧脱氢酶广泛分布予三器系统(吉囊蘩、嚣核窝囊孩生物)中,蹙有多种多样的同工酶,因此其分类比较篾杂。根据其辅酶的不同可以分为两大裁:类是以为辅酶的舞柠橡酸脱氢酶(黼),另一类是以为辅酶斡异柠檬黢脱氢酶(。)。按照其妥萋鹣缝成麓分为謦俸鳖、蠢潦二浆体型和多聚体型。单体型的异柠檬酸脱氢酶只存在于某些低等的原核生物中,以为辅酶,多聚体型的异柠檬黢脱氢酶只存在予真核生物中,以为糖酶,露同潦二蒙体羹秘黪柠檬酸我鬣瓣在原孩窝爽核生豹牵都露分毒,著显楚以为辅酶。而根据酶在细胞内的亚定位,真核生物中异柠檬酸脱氢酶又异柠檬酸的结构与功能研究及与相互作用方式的研究可分为:线粒体异柠檬酸脱氢酶(

8、),细胞质异柠檬酸脱氢酶(),过氧化物酶体异柠檬酸脱氢酶和叶绿体异柠檬酸脱氢酶。系统发生学研究发现异柠檬酸脱氢酶可以被分成三个亚家族:亚家族主要包括来源于古细菌和真细菌的同源二聚体形式的,真核细胞中的同源二聚体形式的组成亚家族,而真核细胞中的多聚体形式的构成亚家族(,)。定位于真核细胞线粒体的基质中,主要参与三羧酸循环,被认为是三羧酸循环的限速酶。哺乳动物细胞中,是由、三个亚基以:形式组成的四聚体,每个四聚体各有两个、异柠檬酸、和金属离子的结合位点()。其中亚基为催化亚基,并包含有一部分的异柠檬酸的结合位点,而、亚基可能参与调节,包含有的结合位点(,)。酵母细胞的是一个异源八聚体,由个亚基和个

9、亚基组成,每个八聚体具有个异柠檬酸结合位点,个、结合位点,为调节亚基,为催化亚基,但酵母一的单个亚基并不具有独立的催化和调节功能(,)。则广泛存在于原核生物和真核生物的各个细胞器(如叶绿体、线粒体和过氧化物酶体)以及细胞质中。原核生物中以大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶()的研究最为广泛而深入。从年等人解析了第一个的结构开始到目前为止,已经有余个包含底物、辅酶、金属离子各种组合的野生型与突变体的结构陆续被测定出来。这些结构和一系列相关的生化实验数据使得我们对的催化机理和调节机制都有了比较清楚的认识。而真核生物中研究最多的一种是位于线粒体中的,另一种是主要存在于细胞质中的,由于其羧基端具有过氧化物酶体的导

10、肽序列(),可以通过与过氧化物酶体膜上的受体相互作用而进入到过氧化物酶体中()。真核生物以酿酒酵母为代表,其的研究较为深入。存在三种:、和,分别定位于线粒体的基质、细胞质和过氧化物酶体中,由三个不同的基因(、和)编码,一三种同工酶氨基酸序列的同源性约为()。为组成型表达,的表达可以被葡萄糖所抑制,其在好氧生长的条件下表达较好,而只在以脂肪酸为唯一碳源生长的情况下表达。人细胞质()是酵母的同源蛋白,由基因编码,将基因引入到酿酒酵母细胞中可以回复其基因敲除后的表型。系统发生学研究发现,真细菌的是从进化而来的(),通过对的一射线晶体学研究找到了负责辅酶专一性识别的氨基酸位点,定点突变替换掉辅酶结合口

11、袋中的某些氨基酸残基,可以使其对辅酶识别的专一性发生改变(,)。到目前为止,在()中一共收录有来源于个物种的个异柠檬酸脱氢酶的结构,其中以上都来自于低等的原核生物,而真核生物来源的异柠檬酸脱氢酶的结构信息并不多。人们对于真核细胞中的分子进化及其与的关系也不太清楚。由于异柠檬酸脱氢酶在能量产生和生物合成代谢中都起着非常重要的作用),因此,大家纷纷开展对真核生物异柠檬酸脱氢酶的结构与功能的研究,这将有助于加深我们对异柠檬酸脱氢酶的了解,进一步认识该类酶的作用方式及其生物学功能。异柠檬酸脱氢酶的催化机制及酶促反应动力学的研究到目前为止,所有已知的异柠檬酸脱氢酶催化反应都必需有一个二价的金属阳离子参与

12、,如、和等。其催化反应大致可以分为五步:()酶、底物、余属离子和辅酶结合形成反应前体复合物(米氏复合物),并从异柠檬酸位的羟基上夺取一个质子。()氢阴离子从异柠檬酸转移到上,生成还原性的和中涮产物一一草酰琥珀酸。()草酰琥珀酸脱羧,生成一分子的二氧化碳。()二氧化碳的释放。()反应复合物解离,释放产物酮戊二酸和酶。其中()一()步的反应进行非常迅速。而反应开始的第一步,反应前体复合物的形成是整个催化反应的限速步骤()。、”,义”一鬯。、一一吣一。沁:沁”一十一,一图异柠檬酸脱氢酶的催化机制一虬,旷矿一舛、弋譬“一啦。矿一匕、吣厂扩,一异柠檬酸的结构与功能研究及与相互作用方式的研究通过等人对大肠

13、轷菌中异柠檬酸脱氢酶()的酶、金属离子帮底耪复台搦()与酶稻赣酶复食物()的晶体缝鞠研究,使我们对该酶的催化机制了解的熙加清楚。反应的主要步骤,一为异柠檬鼗脱氢氧化,从羟基上夺取一个质子传递给酶分子中一个充当路易颊碱的氨基酸残基。中旗子静接受者为站。站距离露狩檬酸上游疆羟基氧最远,为,并腿其几何构象也有利于质予的传递()。由于氢阴离子的传递和脱羧步骤进行褥缀快,米氏复合物的稳定性藏成为决定反应速度快慢的一个十分藿要的因素。值得一提静怒,脱羧反应怒鼠草酰琥珀黢两并非驮异柠檬酸开始的。在草酰琥珀黻脱羧放出二氧化碳的步骤中,要求的质子化作用具有严格的立髂专一性以生成。卜酮戊二羧。其中充当鼹易斯酸的氨

14、熬酸残基为和,它们与异柠檬酸位的羧酸形成氢键,夜脱羧反应之菇往发生簸子纯()。大肠杆菌中异柠檬酸脱氢酶。复台物的一射线晶体结构照示,”在这两个步骤中对子过渡态的稳定起到菲常重要的乍遐。”与异柠檬酸瑾一羧基秽位径基上的氧形成配像键,以稳定强脱氢反应过程中形成的羟基氧上的负电荷。可见,与羰基氧形成的静电作用力,而非盐键或氢键作用,使电子能够从羧基上转移。两在滔瞧反应中心撵除溶剂兹乍瘸,更大大增趣了有“参与配位的中间过渡态(烯醇化物)的静电稳定性,并有利于从革酰琥珀酸的。羧基向烯醇化物上的氧转移负电荷,从而加速脱羧反应的进行(,)。对异柠檬酸脱氢酶的懿促反应动力学研究主要怒通过大肠杼菌异柠檬酸脱氯酶

15、和猪心线粒体的依赖型异柠檬酸脱氢酶,两者分别代液原核和真梭缨骢中异柠檬羧魏氢酶的蠖提。因为不鄹瓣酶可以矮遭分子趋丽遴诧,避两采捌相似的催化机制,所以推测其酶促反应的动力学祝制也可能会趋于榴同。但研究发现,猪心线粒体来源的依赖烈异柠檬酸脱氯酶催化反应采用的是稳态麓撬方式(,),另一令泉源于真捩生戆静异柠檬羧聪氢酶(敬窭一耪贝癸的消化腺)则采用快速平衡的随机方式。与此不同的楚对大肠杆菌弹柠檬酸脱氢酶()稳态有序方式的提出,先结合然后异柠檬酸辩缝合上去,产秘嚣按照二氯纯谈、。【一蘩菠二酸;团熬暝痔镶次释款)。缀通过对其野生型和突变体的动力学常数黔测定,以及产物抑制等实验,得到的数一异柠檬酸的结构与功

16、能研究及与相互作用方式的研究据都表明采用稳态随机方式,并且氧化脱羧的速度要大于产物释放的速度()。这样看来,虽然这些酶具有相同的催化机制,但真核与原核生物中异柠檬酸脱氢酶的酶促反应动力学机制可能不尽相同。因此,开展人源细胞质中异柠檬酸脱氢酶()的酶促反应动力学机制的研究显得尤为重要。异柠檬酸脱氢酶催化活性的调节原核生物催化活性的调节方式以大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶()的活性调节研究为代表,其催化活性是通过磷酸化与去磷酸化作用来调节的,是原核生物中第一个被证明以可逆磷酸化为调节方式的酶(,)。的这种调节方式可以通过乙醛酸旁路来控制细胞内的异柠檬酸的水平。乙醛酸循环是三羧酸循环的一种变化形式,仅在微生

17、物、藻类和高等植物中存在,异柠檬酸裂解酶是这个循环中特有的酶。在三羧酸循环和乙醛酸循环中均起作用,通过调节该酶的活性来调控不同生长条件下异柠檬酸的流向。当在以乙酸盐或能产生乙酰的化合物为碳源的条件下生长时,乙醛酸循环中两种重要的酶异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶被激活,而大约的丧失活性,转化为无活性的磷酸化状态,从而抑制了三羧酸循环,使大部分异柠檬酸进入到乙醛酸循环(,)。磷酸激酶磷酸酯酶(,)催化发生可逆磷酸化作用的是异柠檬酸脱氢酶一磷酸激酶磷酸酯酶(),该酶是一个双功能酶,由基因编码的一条多肽链,既具有激酶活性,又具有磷酸酯酶的活性。编码异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶的基因分别为和,它们与共同存

18、在于一个启动子上,其顺序为、,位于和的下游(。因为的作用位点是上的,所以将其划为丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族成员()。一级序列比较发现,与其他己知的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族成员没有明显的同源性,只找到一个包含有参与激酶活性的三个氨基酸残基(、和)的区域。这些残基在真核生物中的异柠撩黢的维构与功熊磺究及与相强作用方式的磷究对应位点或参与催化或参与的结合。也怒一个,即使在没有底物异柠檬酸存在的条件下,仍具有很强的水解酶活性()。其磷酸激酶、磷鼗醮酶蠢零鼹酶活瞧都是遂遂瓣一个位点来完成麓。的磷酸化催化机制与真核的殛自激酶类似,但与真核骚自激酶不瓣鹣是,识蘩熬建疯物兹三缀终鞫,爵奏核鹃爨鑫激酶鞠只霈要满足

19、一级序列上的要求)。这样看来,结合蛋白底物的位点结构与真核的蛋白激酶的可能会存在着一些不阉。而和异柠檬酸对的催化活性司以起蜀谲节譬灞()。理群怎释发挥乍爱及翔河调节其整亿活往还有待于依靠该酶三维结构的解析来提供信息。静磷酸纯调节上发生磷酸化作用的位点为熊近活性中心的位的丝氨酸残基()。与其它可以发生磷酸化的酶不同,的可逆磷酸讫作用发生予酶与底秘的结合位点,不会导致酶分予上大范围瀚结褐变纯,但磷酸纯后瀚几乎丧失了所有的催化活性(,)。在活性状态下,即该酶去磷酸化,其底物异柠檬酸与侧链的位氧原子形成稳定鸵氢键,这芹唪作用不仅增船了酶与底耪之间的结合力,也对底勃的精确定位提共了帮助。通过对酶与底物复

20、合物结构的静电势计算,并与”发生突变后的结构比较发现,当该丝氨酸贱基被磷酸化露,酶分子与爨柠檬酸的笺键作用被打断,带受电酶磷酸基团占据了底物结合佼点,由于静电排斥移空闼位阻的共同作掰使得酶与底物异柠檬酸的结合被隧断,从而使该酶的催化活性受到抑制(,)。”位子分子的表面,有利于被。识别,并有助子酶与底物异柠檬酸发生相互作用()。含有位点的邀一小段结构单元被称为磷酸化(),磷羧俊分予彝一片层嚣找螺旋之耀,露“位予磷酸化的末端。与该酶萁袍部分的结构钼眈,磷酸化具有比较大的摆动性,这种摆动性可能魁为议别所必需的(,)。对这个上的蕻毯位点懿鞭究显示,莱些特定的点突变,麓够改交该数梭蒙,扶纛一异柠檬酸的结

21、构与功能研究及与相互作用方式的研究恢复磷酸化的酶溺性,提示我们这个磷酸优对于的磷酸化调节具有重要作用()。真核生物毽他活性的调节方式对于真核生物来说,由于存在瞢多种形式酶异柠檬酸脱氢释,其催化活陛的调节方式也势必多样化。以为辅酶的异柠檬酸脱氢酶()是辨源多聚搴,存在于真核麴腿豹线粒薅中,被认为是三羧酸循环的敝速酶。该酶豹催化活性受到别构调节,与异柠檬酸的关系呈形曲线,丽与的关系刚譬双曲线()。腺苷酸等因子对的酶活也有一定的影响,鼹和耱聂囱剐麴谖节,可戳增热酶对疯携筑寒秘力(,),丽反应产魏,及其类似物和则具有负向调节作用(,)。数为壤酶熬鼯拧攘酸聪氯戆(。)是羁源二聚体,在真核细胞的线粒体、细

22、胞浆、建氧化物酶体以及植物细胞的叶绿体中均有分,布。人们试图通过研究真核细胞中的结构,阐明其催化活性的调节方式。已经簿辑了亲滋予猪线粒髂瓣(趣)秘,久源纲麓藏中()的醅体结构,与大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶的结构相比较发现,虽然它们在级序列上的间源性很低(只有),但它们的三级结构非常相似(,)。逮壤挺出了在囊缓缉麓中是磷受可逆磷酸纯喜爱调节懿闽题。而在和中确实存在着对应于磷酸化位点“的氯基酸残基,分别为?和,可能是潜在的磷酸化位点,由于到目前为止还没有在寞竣缀戆孛发褒磷羧亿形式貔(),嚣基因缨分援迄素爱裁裂大肠杆菌的同源基因,也没肖实验数据证明真核细胞可以被磷酸化。弱外,假设真核细胞。也是恿过可逆磷

23、酸化作用来调节活淫瓣,由予焚篡骞不弱豫麴蕤定整魏强王酶,那么在分蠢有弱镪熬器中必需存谯与之对应的,从生物进化的角度来说,这样是极不经济的。所有这些都提示我们,真核细胞可能存在其他的调节方式。一异柠檬酸的结构与功能研究及与相互作用方式的研究异柠檬酸脱氢酶的生物学功能随着异柠檬酸脱氢酶的基因克隆、酶学性质和结构等方面研究的深入,人们对其生物学功能的研究产生了极大的兴趣。在真核生物中,是三羧酸循环的重要限速酶,催化异柠檬酸氧化脱羧生成酮戊二酸和。三羧酸循环作为能量代谢的重要途径,对生物体的生命活动起着重要的作用,能够提供远比糖酵解大得多的能量,而且三羧酸循环不仅仅是糖代谢的重要途径,也是脂质、蛋白质

24、和核酸代谢最终氧化生成二氧化碳和水的重要途径。由于在三羧酸循环中具有重要的地位,因此的活性对于生物体的整个生命代谢都有很大影响。另外,在有些酵母中发现某些线粒体基因的(非翻译区)能与结合(),这种结合导致线粒体基因翻译产物增加倍,但是这些新合成的蛋白与野生型蛋白相比更不稳定,降解速度也提高了倍。因此推测与线粒体基因的这种结合可能导致线粒体基因进行了不正确的翻译(,)。真核生物中除了,还具有不同亚细胞定位的。尽管它们催化的反应与相同,然而对于这类异柠檬酸脱氢酶的生物学功能还不十分清楚。已有的研究结果显示,的功能由反应的双向性决定,具有两种可能:一个是正向反应得到【一酮戊二酸和,【一酮戊二酸可以作

25、为中间产物参与生物体内的合成代谢,则可以提供还原力();另一个是逆向反应得到异柠檬酸,参与以谷氨酸为原料的糖异生途径()。真核生物分布于不同的细胞器,其表达具有不同的组织特异性。线粒体主要分布在心脏和骨骼肌组织();细胞质则在肾脏和肝脏中表现出较高的活性,而在其他部分,尤其是脑组织中的表达量非常少()。尽管存在于不同组织中的功能可能不尽相同,但已有的细胞学实验数据显示,参与调控线粒体和细胞质中的氧化还原平衡,提供的还原力可以帮助细胞修复氧化引起的损伤,起到抗氧化作用()。对于过氧化物酶体,主要通过酵母和人源基因的研究,其存在可能是为过氧化物酶体中消耗和以一酮戊二酸为底物的酶类提供原料(,)。因

26、为过氧化物酶体的膜不能透过小分子物质,这就提出了过氧化物酶体中一一异柠檬酸的结构与功自研究及与相互作用方式的研究是否存在和萁融代谢中闽产物的孬生系统静辩题,过氧佬物酪体的存谯正好提供了一种解释。过氧化物酶体中存在不同的代谢途径,困不霹孵终庭类黧、发育阶段及营养款况两蔽交,其中襄麓翡代谢途径是驻耱酸的氧化。在特寇条件下,过氧化物酶体中参与氧化的酶蛋白被大量诱导袭达。著道氧位携酶镩,基因发生突交,将导致遥氧仡谚黪髂中学多伐谢途径的缺陷,如不饱和月旨肪酸的氧化与植烷酸的降解等。由于过锇化物酶体对予缝撩绥您豹正鬻生理功能卜分重要,诲多疫痰都是困其功能失黉姆竣豹。爨她,研究过瓴化物酶体的生物学功能具有深

27、远的临床意义。本文的工作怒在实验窝已有的研究基础上,开展了人源细胞质()的结构与功能研究,希望通过对该酶及其底物复合物的三维结构的解析和酶学性质的研究,柬逶一步阐明蕊发挥功能的分子视制。这将有助于我们认识泼类酶的催化与调节机制,为进一步研究该类姆家族的生物学功能和分子进化提供依擐。异柠檬酸的结构与功能研究及与相互作用方式的研究二、材料和方法材料和试剂常用试剂和材料()岁,公司产品,购自公司。浓缩蛋白用的超滤管、(截留分子量为)购自公司。初步筛选结晶条件的试剂盒、年、()为公司产品的标准配方,化学试剂为公司的产品。结晶用聚乙二醇为公司产品。蛋白质抑制剂()(公司)。其他化学试剂为公司产品。菌株购

28、自北京博大泰克生物有限公司,为常规质粒扩增菌株。():()(),为表达重组蛋白的常用菌株,由本实验室提供。分子克隆常用工具酶和试剂盒限制性内切酶,连接酶,和高保真聚合酶为公司产品。产物回收、凝胶回收和质粒小量抽提试剂盒均为公司产品。定点突变试剂盒购自公司。引物合成由上海生物工程有限公司完成,测序交由公司完成。仪器;是公司的产品。包括检测器、样品加入泵、样品混合池和峰度收集器。程序控制和数掘分析软件是。公司的一一一动态光散射仪,包括一个温度控制样品室(),控制和数据分析软件是一弊柠檬酸的结构岛功能研究及与相互作用方戏的研究。公司的可冤毙,紫多分光毙凌计及其配套软件蘑束测定熬豹活力,并进行动力学常

29、数的分析测算。一射线衔射仪为理学(,)公司产晶,装备”磷屏探测耩、旋转阳极菱玺秣(毽)、锇聚党镜程低瀑氮气流发生器。控制和数据处理软件是()。其它仪器:凝胶成像系统(公司)、蛋白电泳设备()、超净工作台()、计(公司)、电子天平(公落)、冷冻离心机(公司)、高速离心机、(公司)、冰箱(公司)、超低温冰衽(公司)、微波炉()、超声波破碎饺(公司)、磁力搅拌器型、脱色求平摇床、鼓风干燥箱、隔水恒温培养箱一、搬荡培养箱、超声波渣洗权一、强篾过滤器、艨辑冷框(公司)、水浴锅型、离溢蒸汽消毒销(麟镯)、计算机(、)、作站等。方法的表达载体的构建全长()克隆至()表达质粒中,使之具有羧基端的个组氨酸耘签,

30、然后转化蛩()表达菌拣孛。的表达和纯化。踅缝表达从转化有表达质粒的()氮苄抗性平板上挑取单克隆,接种于(含),。掇荡培养过夜。过夜培赛蓥滚接静(含),振荡培养,、时,按:放大至(含),继续培养鬟、,加入至终浓度为,转移摇床,振荡培养,时。,离心投集藿体,逶致蒸东鬟懋惹,再次凑心,藿嚣沉淀冻存予。套爱。,异柠檬酸的结构与功能研究及与相互作用方式的研究的纯化菌体化冻后加入预冷的裂解缓冲液,(),】(菌体),充分打散菌泥,然后加入溶菌酶,使其终浓度为,冰上放置小时。然后盐冰浴上超声裂解,每次秒,间歇秒,循环次,功率瓦。,离一,分钟,留取上清。加入事先用裂解缓冲液平衡的填料(裂解上清),缓慢混合小时后

31、,于。进行亲和层析:将上清与、填料混合物加入到空柱中,填料在重力作用下自然沉积。先用裂解缓冲液洗柱,至紫外检测稳定或,约个柱床体积。再用清洗缓冲液(,(),咪唑)洗柱至紫外检测稳定或,约个柱床体积。最后用洗脱缓冲液(,(),眯唑)沈脱,约个柱床体积,收集得到的蛋白,并耿样进行电泳鉴定。合并收集到的蛋白组分,加入到截留分子量为的透析袋中,置于预冷的升透析缓冲液(,)中,透析,每隔小时更换透析液,换液次后取出蛋白样品。加入到截留分子量为的超滤管中,以,。离心浓缩至。再将样品加入到事先用透析缓冲液平衡好的分子筛预装柱,流速控制在,收集呈高斯分布的蛋白峰。取样进行电泳鉴定。将目的蛋白(分子量为)组分加

32、入到截留分子量为的超滤管中以,离心浓缩至约。这时将最终得到的蛋白样品分装于的离心管中,迅速放入液氮中冷冻,随即转入低温冰箱保存以备后续实验使用。溶液中蛋白质分子尺寸和聚集状态的分析运用动态光散射仪对样品在溶液状态下的分子运动进行分析。按照()生产商的使用手册,将浓缩后的蛋白稀释为约,样品用量为山,通过软件调控样品室的温度,分析不同温度下蛋白质分子的尺寸大小和聚集情况。蛋白质浓度的测定方法一异柠檬酸的结构与功能研究及与相互作用方式的研究根据给定序列中生色基团的含量估算吸光系数。经验公式()给出蛋白的吸光系数()。其中、别代表色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的个数,是蛋白的分子量。的吸光系数为。用实际测得

33、的下的吸光值,除以上面估算的吸光系数,得到样品的浓度。晶体生长气相扩散(悬滴)法蛋白质样品的准备从低温冰箱取出冻存的样品(含甘油),对倍体积的透析缓冲液(,)透析时,转移至(截留分子量为,),浓缩至。,离心分钟,以去除沉淀,转移上清至一新离心管。用透析缓冲液分别稀释到、三种浓度。其中部分样品添加底物、辅酶和金属离子。脱辅基酶及复合物的结晶条件筛选和优化采用气相扩散(悬滴)法生长晶体,在硅化处理好的盖玻片上样品与同体积的结晶溶液混合,下槽液为,真空脂密闭,保持温度恒定(。,),使每一个样品槽能够达到平衡。初筛时,在实验完成后每天观察一次,并记录液滴状态(清亮、沉淀或出现微晶等)。筛选策略采用稀疏矩阵采样法(),细格子法(,)。每个条件都采用三种不同的蛋白浓度,在得到一定的潜在结果后,通过改变蛋白浓度、值、沉淀剂的浓度,以及加入一些添加剂(,)来进行优化,得到可以衍射的单晶。射线晶体衍射和数据的收集及处理利用低温氮气流冷冻保护条件()进,结合底物和辅酶的复合物晶体的一射线衍射。用适当大小的在显微镜下操作,捞取复合物晶体,放入事先准备

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