抗H5N1禽流感病毒羊驼重链单域抗体的制备和功能鉴定

1、本文受国家863项目（2006AA02A252）和上海市教委第五期重点学科（J50207）资助上海交通大学医学院，上海市免疫学研究所，上海200002作者简介：夏立亮（1984年），男，硕士，主要从事基因工程抗体研究；通讯作者及指导教师：王颖（1969年），女，博士，副研究员，主要从事免疫学研究，同时就职于上海交通大学医学院，上海市免疫学研究所，E-mail ：ywang sibsaccn 。doi ：103969/jissn1000-484X201202009·禽流感与免疫·抗H5N1禽流感病毒羊驼重链单域抗体的制备和功能鉴定夏立亮吴标程亚庭包文静赵国屏王颖（上海人类基因

2、组研究中心上海市疾病与健康基因组重点实验室，上海201203）中国图书分类号R39211文献标识码A文章编号1000-484X （2012）02-0137-06摘要目的：获得具有中和活性、高特异性和稳定性的抗H5N1禽流感病毒血凝素蛋白（HA ）的羊驼重链单域（VHH ）抗体。方法：利用pET-22b 表达载体诱导表达抗H5N1禽流感病毒HA VHH 抗体蛋白，以包涵体形式表达的VHH 抗体蛋白采用最优复性方法进行复性后，获得高纯度的VHH 抗体，分别采用ELISA 法鉴定VHH 抗体的亲和力和热稳定性，采用血凝抑制实验鉴定抗体的特异性和体外中和活性。结果：经复性的抗H5N1禽流感HA VHH

3、 抗体对H5N1禽流感病毒HA具有良好的特异性。通过对三种不同复性方法比较，利用柱上复性的VHH23抗体具有较好的热稳定性，亲和力为91 107mol /L，同时对H5N1禽流感病毒HA 具有良好的体外中和活性。结论：实验结果表明通过原核表达获得具有较好中和活性、特异性及稳定性的抗H5N1禽流感病毒VHH 抗体，为进一步开展抗体的体内病毒中和试验奠定良好基础。关键词H5N1禽流感病毒；重链可变区抗体；包涵体复性；活性鉴定Preparation and characterization of recombinant VHH antibody against H5N1hemagglutinin f

4、rom avian influenza virusXIA Li-Liang ，WU Biao ，CHENG Ya-Ting ，BAO Wen-Jing ，ZHAO Guo-Ping ，WANG-YingChinese National Human Genome Center at Shanghai ，Shanghai Key Laboratory of Health and Genomics ，Shanghai 201203，ChinaAbstract Objective ：To prepare and characterize camelid VHH antibody against hem

5、agglutinin from H5N1avian influenza vi-rusMethods ：Recombinant expression vector pET-22b-VHH23was constructed and VHH antibody against hemagglutinin from H5N1avian influenza virus was expressed in Ecoli BL21（DE3）strain by IPTG inductionAs VHH antibody protein was expressed in inclu-sion body ，there

6、different refolding methods were compared for the refolding of VHH antibody in which the optimal methods were adopt-ed for preparation of VHH antibodyThe activity and thermal stability of VHH antibodies were tested by ELISA while hemagglutination-inhibition assay was perfomed to determine the specif

7、icity and neutralizing activityResults ：By using on-column refolding procedure ，VHH antibody has been obtained with highest yield and good qualityThis antibody specifically recognized hemagglutinin derived from H5N1avian influenza virus as well as in vitro inhibition against hemagglutinin-mediated r

8、ed blood cell agglutinationThe affinity con-stant of VHH antibody was 91 107mol /Las determined by ELISAMore interestingly ，VHH antibody displayed high thermal stabili-tyConclusion ：The results indicated that VHH antibody against hemagglutinin derived from H5N1avian influenza virus has been ob-taine

9、d with high activity ，specificity as well as good thermal stability by using prokecyte expressing system ，which provides basis for fu-ture functional study in vivoKey words Avian influenza A （H5N1）virus ；Variable domain of heavy chain antibody ；Refolding of proteins from inclusionbodies ；Determinati

10、on of bioactivity高致病性禽流感是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒（Avian influenza virus ，AIV ）引起的禽类烈性传染病。自1997年香港报道全球首例人感染高致病性H5N1亚型禽流感病毒后，改变了AIV 不能直接传播人类的传统观念1。据WHO 统计，至2011年4月11日止，全球由H5N1病毒感染的人禽流感患者为549人，死亡320人，死亡率高达5829%2。高致病性禽流感病毒H5N1不仅对禽类带·731·夏立亮等抗H5N1禽流感病毒羊驼重链单域抗体的制备和功能鉴定第2期来巨大威胁，严重影响国家的经济发展，还对人类健康带来巨大威胁，

11、因此如何有效应对高致病流感的大流行和寻找更有效的治疗方法已引起全球性的高度关注。在对流感疫情的防控中，除现在全球最常用的生产特异性疫苗以外，具有中和活性的治疗性抗流感抗体的制备也可成为预防流感的重要手段之一。治疗性抗体的发展已经从早先的鼠源性抗体发展到人源或是全人抗体，从而大大降低了抗体在人类中重复使用的异源性。1993年Hamers 等3研究发现，在骆驼血清中存在一种天然缺失轻链的活性抗体，称之为重链抗体，其可变区称为VHH 抗体。与传统抗体相比，VHH 具有分子量小、易表达、穿透性强、高特异性和高亲和力、高溶解性和稳定性、免疫原性低、可识别独特构象的抗原表位等优点，使其作为一种小型化的基因

12、工程抗体在基础研究、药物开发等领域具有广阔的前景4-6。目前已有多种重链单域抗体进入临床实验7，8。我们在先期研究中构建完成了抗H5N1禽流感病毒血凝素蛋白VHH 抗体库9，并采用固相筛选方法筛选获得了针对禽流感病毒血凝素蛋白（HA ）的多个VHH 噬菌体抗体基因。HA 是一种跨膜糖蛋白，以三聚体形式存在于病毒囊膜表面，在病毒吸附、穿膜及决定病毒的宿主特异性和致病力等方面起着关键的作用，是禽流感病毒最主要的表面抗原及有效的抗体中和靶点10。利用HA 制备抗AIV 的VHH 抗体，对AIV 的诊断及治疗具有重要意义。本研究将在上述工作的基础上，对一株分泌上清具有较好中和活性的抗HA 的VHH23

13、抗体蛋白进行原核表达，通过包涵体复性，获得了具有较好活性、特异性及稳定性的VHH 抗体，为进一步优化抗体性质，开展其在临床检测中的应用研究奠定基础。1材料与方法11材料111菌种和质粒大肠杆菌DH5、BL21（DE3）、表达质粒pET-22b 由本实验室保存。112工具酶和试剂高保真DNA 聚合酶Prime STAR 、BamH 、Hind 、DL 2000、DNA 连接酶、低分子量蛋白标准等购自TaKaRa ；DNA 凝胶回收试剂盒，质粒小抽提试剂盒购自AXYGEN ；其他生化试剂购自上海生工；重组禽流感病毒血凝素（H5N1亚型，Re-4株）及禽流感H5、H7、H9亚型血凝素购自哈尔滨维科生

14、物技术开发公司；重组H5N1禽流感病毒血凝素HA1A /Anhui/1/2005（H5N1）购自北京义翘神州生物技术有限公司；HRP-Anti-6Histag 抗体购自RD ；HRP-Goat anti-Mouse IgG 购自Jackson ；抗H5N1禽流感病毒血凝素鼠源性抗体H5M9由南方医科大学车小燕老师惠赠。12方法121重组表达载体pET-22b-VHH23的构建以从噬菌体抗体库筛选得到的pCANTAB5E-VHH23为模板，利用高保真DNA 聚合酶Prime STAR ，以上游引物：5'-GAGTC-3' 及下游引物：5'-TTTCCCAAGCTTGGAG

15、A-CGGTGACCTGGGTCCC-3' ，进行扩增。得到目的片段经BamH 和Hind 双酶切后与经同样双酶切的表达载体pET-22b 进行连接并转化DH5，挑选阳性克隆，并经双酶切鉴定后送测序鉴定。122pET-22b-VHH23重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）及诱导表达将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。挑取阳性单菌落于含有氨苄青霉素（50g /ml）的LB 液体培养基中，37 ，200r /min过夜培养。按1/100的比例转接后，继续培养2小时左右，使OD 600约为08，加入终浓度为1mmol /L的IPTG ，继续培养4小时。收获菌体，通过SDS-

16、PAGE 对重组蛋白的表达及表达形式进行鉴定。123重组VHH23包涵体抗体的纯化及复性对900ml 菌液进行诱导表达，收集菌体后均分三份，采用三种不同复性方法进行蛋白复性。具体步骤如下：向每份菌体中加入16ml 细胞裂解缓冲液（50mmol /LTris-Cl pH80，1mmol /LEDTA pH80，100mmol /LNaCl ），400l 10mg /ml的溶菌酶，重悬菌体，20 反复冻融三次，利用超声破碎，至菌液不再粘稠。4 ，10000r /min，离心20分钟，收集沉淀，用洗涤液（50mmol /LTris-HCl ，50mmol /LNaCl ，20%（v /v）Trito

17、n X-100，2mmol /L-巯基乙醇，2mmol /L尿素，pH80）洗涤沉淀后，4 ，10000r /min，离心20分钟，收集沉淀。然后用50mmol /LTris-HCl 缓冲液（pH80）洗涤，4 ，10000r /min，离心20分钟，收集沉淀。将沉淀A 用10ml 含8mol /L尿素的PBS 溶解，沉淀B 用Buffer B （8mol /L尿素，100mmol /LNaH 2PO 4，100mmol /LTris-HCl ，pH80）溶解，沉淀C 用变性液（50mmol /LTris-HCl ，50mmol /LNaCl ，1mmol /LEDTA ，100mmol /L

18、-巯基乙醇，7mol /L盐酸胍）溶解，然后4 ，12000r /min，离心20分钟，收集上清。沉淀A 采用柱上复性的方法，将上清上样到·831·中国免疫学杂志2012年第28卷Ni-NTA 亲和层析柱后，分别用含6、4、2、1、0mol /L尿素的PBS （含1. 0mmol /L还原型谷胱甘肽，01 mmol /L氧化型谷胱甘肽）连续洗柱，最后用含有250mmol /L咪唑的PBS 对目的蛋白进行洗脱，4 ，PBS 中搅拌透析。沉淀B 采用透析复性，按照Qiagen 公司的Ni-NTA 亲和层析柱使用说明书纯化目的蛋白。将Buffer E （8mol /L尿素，100

19、mmol /LNaH 2 PO 4，100mmol /LTris-HCl ，pH45）洗脱的目的蛋白在透析液（pH80PBS ，1. 0mmol /L还原型谷胱甘肽，0. 1 mmol /L氧化型谷胱甘肽，002%-巯基乙醇，6 mol /L尿素）中4 进行搅拌透析，并逐渐降低透析液中的尿素浓度，最后用PBS 透析。沉淀C 采用高蛋白质浓度下的复性11，向上清中加入稀释液（50mmol /LTris-HCl ，50mmol /L NaCl ，1mmol /LEDTA ，100mmol /L-巯基乙醇，pH80）至所有可溶性蛋白再次沉淀。10000r / min ，30分钟，4 ，离心收集沉淀，

20、并用50mmol /L Tris-HCl 缓冲液（pH80）洗涤，将沉淀用变性液（50mmol /LTris-HCl ，150mmol /LNaCl ，100mmol /L-巯基乙醇，8mol /L尿素，pH85）室温下溶解，10000r /min，30分钟，4 离心收集上清。调整溶液蛋白浓度至8mg /ml，加入80倍体积的复性液（20 mmol /LTris-HCl ，150mmol /LNaCl ，10mmol /L还原型谷胱甘肽，01mmol /L氧化型谷胱甘肽，pH80），4 搅拌过夜。10000r /min，20分钟，4 离心收集上清，经超滤管适当浓缩后4 、PBS 中搅拌透析。透

21、析结束后，利用超滤管对上述复性蛋白溶液进行适当浓缩后，测定蛋白浓度，并经SDS-PAGE 电泳鉴定蛋白纯度。124ELISA 鉴定复性VHH23抗体活性采用间接ELISA 测定三种复性方法复性后的抗体效价。取10g /ml重组H5N1禽流感病毒血凝素HA1A / Anhui /1/2005（H5N1）包被96孔板，100l /孔，4 过夜。取包被板，弃多余包被抗原后，经BSA 封闭后加入梯度稀释的复性抗体，37 、孵育15小时。二抗采用1 5000稀释的HRP-Anti-6Histag （RD ），37 ，孵育1. 5小时后采用OPD 显色，OD 492读数。125血凝抑制实验Hemagglu

22、tination-inhibition （HI ）assay 分别采用禽流感H5、H7、H9亚型血凝素对复性抗体进行血凝抑制实验，验证抗体的特异性；用重组禽流感病毒血凝素（H5N1亚型，Re-4株）对复性抗体进行血凝抑制实验，测定其血凝抑制滴度。实验方法见文献9。126非竞争ELISA 测定抗体亲和力按照5、 2. 5、125、0625mg /L浓度包被抗原HA1，将复性抗体以01mg /ml为起点，进行11次倍比稀释，以非竞争ELISA 测定抗体亲和力方法测定复性抗体的亲和力12。127抗体的热稳定性测定将复性抗体分别在30、40、50、60、70、80、90 水浴中处理20分钟，然后平衡至

23、室温，通过间接ELISA 方法测定抗体的活性。将从腹水纯化的抗H5N1禽流感病毒血凝素鼠源性抗体H5M9经过相同处理后作为对照13。2结果21pET22b-VHH23重组表达质粒的构建及鉴定图1显示重组表达质粒经BamH 和Hind 双酶切后出现两条条带，分别为载体条带55kb 和目的条带380bp ，测序结果显示重组表达载体构建正确。22VHH23抗体蛋白的初步诱导表达将转化有pET22b-VHH23的BL21（DE3）经IPTG 诱导表达后，收集诱导菌体，用裂解缓冲液将菌体重悬后进行超声破碎，4 ，12000r /min，离心5分钟，分别对上清液和菌体沉淀物进行SDS-PAGE 电泳，对目

24、的蛋白是否表达及表达形式进行鉴定。从图2中可以看出重组VHH23抗体以包涵体的形式表达，蛋白分子量为18kD 。23重组抗体的复性及纯化实验以三种复性方法为平行实验，分别从300ml 诱导菌液中提取包涵体并进行复性，由表1可知按照高蛋白质浓度下复性C 组所得复性抗体产量最高，而透析复性B 组最低，图3显示每种抗体都取得较好纯化效果，与方法C 相比，方法A 和B 由于采用金属亲和层析纯化目的蛋白，在21 22kD 出现了较弱的非特异性杂带 。图1pET22b-VHH23酶切电泳结果Fig1Restriction enzyme analysis of pET22b-VHH23 Note ：1pET

25、22b-VHH23/BamH+Hind ；2pET-22b /BamH+ Hind ；3DNA marker DL 2000·931·夏立亮等抗H5N1禽流感病毒羊驼重链单域抗体的制备和功能鉴定第2期24复性VHH 抗体的免疫学活性对ABC 三组复性抗体，以004mg /ml为起始浓度进行倍比稀释，ELISA 结果显示A 组柱上复性所得抗体活性最好，效价为0000156mg /ml，其次为B 组透析复性，效价为00003125mg /ml，最后为C 组，效价为0. 00125mg /ml。25血凝抑制实验分别用禽流感H5、H7、H9亚型血凝素对复性抗体进行血凝抑制实验，实验

26、结果显示复性抗体只对H5亚型血凝素具有血凝抑制效应，表明我们所获得的VHH 抗体具有较好的特异性；用重组禽流感病毒血凝素（H5N1亚型，Re-4株）对复性抗体进行血凝抑制实验，结果显示A 组柱上复性所得抗体中和活性最好，血凝抑制效价为00085mg /ml，其次为B 组透析复性，血凝抑制效价为00170mg /ml，最后为C 组，血凝抑制效价为00680mg /ml。26VHH 抗体的亲和力测定选取ELISA 活性及血凝抑制活性均较好的柱上复性VHH23 抗体进行图2重组VHH23抗体诱导表达的SDS-PAGE 电泳图Fig2SDS-PAGE analysis for the inducibl

27、e expression of recombinant VHH23antibodyNote ：MStandard protein marker ；1Supernatant of lysate from EcoliBL21（DE3）；2Supernatant of lysate from Ecoli BL21（DE3）with pET-22b-VHH23induced by IPTG ；3Sediment of lysate from Ecoli BL21（DE3）with pET-22b-VHH23induced by IPTG表1三种不同复性方法所得VHH23产量Tab1The yield

28、and activity of VHH23from 3different refolding methodsRefolding methodsYield （mg ）ELISA titer （mg /ml）HI activity （mg /ml）A （on-column refolding ）3674000015600085B （dialysis refolding ）19530000312500170C （method in reference 10）661000012500680抗体亲和力测定。按照非竞争ELISA 测定抗体亲和力方法，以抗体浓度为横坐标，OD 492值为纵坐标作图，可以得到

29、四条对应不同抗原浓度的“S ”型曲线（见图4），在4条曲线中，对应着4个不同的1/2OD 492max ，同时对应着4个抗体浓度，n 值为抗原浓度稀释倍数，将其代入公式：Ka =（n-1）/2（n AbAb t ），每个数据用两次，可得到4个Kd ，取其平均值，最终计算得到VHH23抗体亲和力为91 107mol /L。27抗体的热稳定性实验中将A 组柱上复性抗体经各种温度处理后依次进行倍比稀释，通过间接ELISA 测定抗体的活性，以评估VHH 抗体的热稳定性。由图5可知VHH23经60 处理20分钟抗体活性无损失，当经70 处理20分钟后抗体活性将为原活性的50%，而对照组鼠源性抗体H5M9

30、经50 处理20分钟后抗体活性将为原活性的25%，由此可知复性VHH23抗体具有较好的热稳定性 。图3VHH23纯度鉴定SDS-PAGE 图Fig3SDS-PAGE for the purified recombinant VHH23Note ：MStandard protein marker ；1Purified VHH23in group A ；2Puri-fied VHH23in group B ；3Purified VHH23in group C图4非竞争ELISA 法测定VHH23抗体亲和力Fig4Determination of affinity constant of VHH23

31、by non-competitive ELISA assay·041·中国免疫学杂志2012年第28卷 图5VHH23抗体的热稳定性分析Fig5Determiantion of thermal stability of VHH23anti-bodyNote ：Thermal stability of anti-HA VHH 23（，as compared to one a-vailable mouse anti-HA monoclonal antibody H5M9（）Anti-bodies were incubated at increasing temperatures

32、 for 20min ，reequilibrated to RT ，and then assayed in the standard HA ELISA3讨论外源重组蛋白在大肠杆菌表达系统中进行高效表达时，由于表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键，从而影响重组蛋白的正确折叠，造成表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒，即包涵体。以包涵体形式表达的抗体不具有活性，为了实现VHH 抗体的可溶性表达，获得有活性的抗体，我们通过降低诱导剂浓度（10、08、06、04、02、01、005 mmol /L）、降低诱导温度（01mmol /LIPTG ，30 ，6小时

33、；26 ，10小时；20 ，过夜）；向培养基添加04 mmol /L葡萄糖等对表达条件进行优化，但实验结果显示以上方法均不能实现VHH23的可溶性表达。包涵体的形成虽然能造成重组蛋白失活，但另一方面它可以保护重组蛋白在细胞内免受蛋白酶的降解，从而提高表达量，并便于重组蛋白的纯化，另外，经过适当的复性方法，重组蛋白可以获得活性。本实验比较了透析复性、柱上复性、高蛋白质浓度下的复性等三种方法对VHH23抗体蛋白复性的有效性。实验中采用pH80，4 的复性环境，偏碱性pH 环境有利于蛋白质的折叠和二硫键的交换，而较低的温度可以减少蛋白的聚集反应。还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽作为氧化还原试剂以促使不

34、正确配对的二硫键发生快速交换反应，从而提高二硫键正确配对率。实验中获得复性抗体的产量C 组A 组B 组，而复性的抗体活性则是A 组B 组C 组，C 组高蛋白质浓度下的复性虽然获得抗体产量最高，但活性较低，复性效果较差。与透析复性及高 蛋白质浓度下的复性相比，柱上复性效率较高、快速、样品稀释倍数小，更适合大量复性蛋白的制备。VHH 抗体作为一种新型的基因工程抗体，以其结构的独特性，抗体功能的优越性而受到广泛关注。实验中抗H5N1禽流感病毒血凝素蛋白小羊驼重链可变区抗体VHH23分子量只有18kD ，比分子量为30kD 的单链抗体（scFv ）还要小，并且易表达，在E . coli 中表达后，经过

35、Ni-NTA 亲和层析纯化，产量可达11mg /L。由于在噬菌体抗体库的筛选过程中，先采用H5N1禽流感病毒血凝素抗原对特异性抗体进行富集，再利用血凝抑制实验来验证所筛选抗体的活性，因此复性后的VHH23具有很好的抗原特异性，在体外具有良好的针对H5N1禽流感病毒的中和活性。同时，我们的研究结果也显示VHH 抗体相比于常规的抗体具有更好的热稳定性14，本实验中VHH23抗体在60 处理20分钟后活性没有改变，与传统抗体相比具有更好的热稳定性。抗体的亲和力参数是衡量抗体有效性的重要指标之一，为此我们采用了ELISA 法测定了成功复性的VHH23抗体分子，亲和力为107数量级，虽然相对于鼠源性抗体

36、的亲和力低了两个数量级，但是由于我们现在所获得的是单域抗体，只有一个抗原结合位点，所以其亲和力要低于双价抗体，这个可以通过构建完整的重链抗体提高其亲和力。事实上，在实际应用过程中，VHH 单域抗体由于分子量过小不能被直接应用于治疗，因为其进入体内后将被肾脏迅速滤过排出，所以必须通过构建完整重链抗体分子才能够实现其后续应用。本研究先行对VHH23抗体的生物学和免疫学特性进行了分析，也为下一步的抗体改造奠定良好的基础。综上所述，本实验采用原核表达方法诱导表达了羊驼抗H5N1禽流感病毒羊驼重链抗体蛋白，并通过柱上复性的方法获得了具有较好免疫学活性、特异性及稳定性的抗H5N1禽流感病毒VHH 抗体，为

37、后续开展VHH 抗体的改造和体内抗病毒中和研究奠定良好的基础。4参考文献1Claas E C ，Osterhaus A D ，van Beek R et al Human influenza A H5N1virus related to a highly pathogenic avian influenza virus J Lancet ，1998；351（9101）：472-4772WHO Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influ-enza A /（H5N1）Reported to WHO J /OL2011（http

38、 ：/wwwwhoint /csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2011_04_ 11/en /indexhtml ）（下转第160页）·141·夏立亮等抗H5N1禽流感病毒羊驼重链单域抗体的制备和功能鉴定第2期· 160· traumatic lesions of the CNS and brain injuries following dramatic circulatory arrests： an immunohistochemical studyJ Pathol Res Pract， 2

39、000 ； 196 （ 1 ） ： 1521 11 Lucero J， Heo J H et al Rapid differential endogenous Hosomi N， plasminogen activator expression after acute middle cerebral artery occlusionJ Stroke， 2001 ； 32 （ 6 ） ： 13411348 12 Zhang R L， Zhang L， Jiang Q et al Postischemic intracarotid treatment with TNKtPA reduces inf

40、arct volume and improves neurological deficits in embolic stroke in the unanesthetized ratJ Brain Res， 2000 ； 878 （ 12 ） ： 6471 13 Melchor J P， Strickland S Tissue plasminogen activator in central nervous system physiology and pathology J Thromb Haemost， 2005 ； 93 （ 4 ） ： 655660 14 Cheng T， Guo H et

41、 al Tissue plasminogen activator neurovasLiu D， cular toxicity is controlled by activated protein CJ Nat Med， 2004 ； 10 （ 12 ） ： 13791383 15 Nagai N， Yamamoto S， Tsuboi T et al Tissuetype plasminogen activator is involved in the process of neuronal death induced by oxygenglucose deprivation in cultu

42、re J J Cereb Blood Flow Metab， 2001 ； 21 （ 6 ） ： 631634 16 Vexler Z S， Sharp F R， Feuerstein G Z et al Translational stroke research in the developing brainJ Pediatr Neurol， 2006 ； 34 （ 6 ） ： 21 20 19 18 17 459463 中国免疫学杂志 2012 年第 28 卷 Sprague S， Lai Q et al Blood brain barrier （ BBB ） dysPatel T H，

43、function associated with increased expression of tissue and urokinase plasminogen activators following peripheral thermal injuryJ Neu2008 ； 444 （ 3 ） ： 222226 rosci Lett， Kelly P J， Morrow J D， Ning M et al Oxidative stress and matrix metalloproteinase9 in acute ischemic stroke： The biomarker evalua

44、tion Stroke） studyJ Stroke， for antioxidant therapies in stroke （ BEAT2008 ； 39 （ 1 ） ： 100104 Siao C J， Tsirka S E Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin J J Neurosci， 2002 ； 22 （ 9 ） ： 33523358 Ruxun H， Jun H et al Expression of PAI1 in is

45、chemic focus Ling L， and perifocal areas after 2 hours focal cerebral ischemia with reperfuJ Chinese J Pathophysiology， 2004 ； 20 （ 3 ） ： 417420 sion in rats Hua Y， Xi G， Keep R F et al Plasminogen activator inhibitor1 induction after experimental intracerebral hemorrhage J J Cereb Blood Flow Metab，

46、 2002 ； 22 （ 1 ） ： 5561 0805 收稿 2011- 0820 修回 2011（ 编辑 倪 鹏） （ 上接第 141 页） 3 HamersCasterman C， Atarhouch T， May lermans S et al Naturally oc Nature， 1993 ； 363 curring antibodies devoid of light chains J （ 6428 ） ： 446448 4 5 Gottlin E B， Xiangrong G， Pegram C et al Isolation of novel EGFRJ J Biomol Screen， 2009 ； 14 （ 1 ） ： 7785 specific VHH domains Kastelic D