替米沙坦对压力超负荷大鼠心肌内皮素-1表达和GATA DNA结合活性的影响

1、替米沙坦对压力超负荷大鼠心肌内皮素-1表达和GATA DNA结合活性的影响         11-01-11 11:30:00     编辑：studa20                作者：苟晓燕 李法琦 周希 余江恒 周平 陈运贞【摘要】  目的研究压力超负荷心肌肥厚大鼠心肌组织(GATA)DNA结合活

2、性和内皮素(ET)-1蛋白表达的变化及其意义，观察替米沙坦对压力超负荷心肌肥厚大鼠血流动力学参数收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和平均压(MBP)、左室质量指数(LVMI)、心肌细胞横径(DC)、心肌组织GATA DNA结合活性和ET-1蛋白表达的影响。方法腹主动脉缩窄法建立压力超负荷大鼠心肌肥厚模型。健康SD大鼠24只，随机分为三组：假手术组(n=8);手术组(n=8);替米沙坦组(手术后第7天给替米沙坦3 mg·kg-1·d-1灌胃4 w，n=8)。测定大鼠SBP、DBP、MBP、LVMI及DC;免疫组化半定量检测心肌组织ET-1蛋白的表达，电泳迁移率变动分析检测ET

3、-1与GATA的特异性结合及GATADNA结合活性的变化。结果与假手术组比较，手术组SBP、DBP、MBP、LVMI和DC均显著升高(P均<0.05);光镜下见心肌实质、间质结构改变;心肌组织ET-1蛋白表达和GATA DNA结合活性均明显增加(P均<0.05);心肌组织ET-1蛋白表达与LVMI和DC均呈显著正相关(r=0.895，r=0.899，P均<0.01);与手术组比较，替米沙坦组SBP、MBP、LVMI、DC、心肌组织ET-1蛋白表达和GATA DNA结合活性均明显降低(P均<0.05)。结论(1)GATA DNA结合活性增加使ET-1蛋白表达增加与压力超负

4、荷大鼠的心肌肥厚有关;(2)替米沙坦能够抑制压力超负荷大鼠的心肌肥厚，其机制可能与替米沙坦降低GATA DNA结合活性从而下调ET-1蛋白表达有关。 【关键词】  心肌肥厚;内皮素-1;GATA转录因子;替米沙坦【Abstract】ObjectiveTo study the change and significance of endothelin-1 (ET-1) protein expression and GATA DNA binding activity in myocardium of rats with left ventricular hypertrophy induc

5、ed by pressure overload and investigate the effects of telmisartan on hemodynamic parameters systolic blood pressure (SBP), diastolic blood pressure (DBP) and mean blood pressure (MBP), left ventricular mass index (LVMI) and transverse diameter of myocardial cell (DC) as well as ET-1protein expressi

6、on and GATA DNA binding activity in myocardium of rats with left ventricular hypertrophy induced by pressure overload.MethodsExperimental rats with left ventricular hypertrophy induced by pressure overload were established by partially banding abdominal aortic artery. 24 healthy SD rats were randoml

7、ydivided into three groups: sham-operated group (n=8); operated group (n=8) andtelmisartan group (telmisartan 3 mg·kg-1·d-1 per gavage, from 7th day to 4 weeks after operation, n=8). Hemodynamic parameters, LVMI and DC were measured.ET-1 protein expression in myocardium was determined by i

8、mmunohistochemistry assay. The specific combination of ET-1 with GATA and GATA DNA binding activity were analyzed with electrophoretic mobility shift assays (EMSA).ResultsCompared with sham-operated group, SBP, DBP, MBP, LVMI, DC, ET-1 protein expression and GATA DNA binding activity were significan

9、tly increased (all P<0.05); and ET-1 protein expression was correlated positively with LVMI and DC (r=0.895, r=0.899, allP<0.01) in operated group. Compared with the operated group, SBP, MBP, LVMI, DC,ET-1 protein expression and GATA DNA binding activity were significantly reduced in telmisart

10、an group (all P<0.05).Conclusions(1) The upregulation of ET-1 protein expression triggered by increase of GATA DNA binding activity is correlated with left ventricular hypertrophy of rats induced by pressure overload. (2)Telmisartan can prevent left ventricular hypertrophy of rats induced by pres

11、sureoverload through downregulation ET-1 protein expression by decrease of GATA DNAbinding activity.【Key words】Left ventricular hypertrophy; Endothelin-1; GATA transcription factors; Telmisartan心肌肥厚是独立的心血管危险因素已被公认，但其发病机制目前仍未完全明了，对最终导致心肌肥厚性增长的分子机制与心肌肥厚时调控心脏基因表达的转录因子在很大程度上仍然未知。GATA是一个具有多样锌指结构的转录因子家族系列

12、，调节很多与心肌肥厚相关基因的表达，如内皮素(ET)-1。ET的启动子中含有GATA成分，当GATA转录因子与其启动子中GATA成分结合后可调节其基因的表达。本实验通过部分缩窄大鼠腹主动脉建立心肌肥厚模型，研究心肌组织中GATA DNA结合活性和ET-1蛋白表达的变化，试图从GATA与ET-1的作用上研究压力超负荷心肌肥厚的机制。替米沙坦属于血管紧张素受体阻滞剂(ARB)类降压药物，在降低血压的同时能够抑制心肌肥厚但机制并未完全阐明，尚未见替米沙坦调节GATA DNA结合活性影响ET-1表达从而阻止心肌肥厚的报道。本研究在压力超负荷心肌肥厚大鼠模型建立成功后1 w，用替米沙坦进行干预4 w，观

13、察其对大鼠血流动力学、心肌肥厚、GATA DNA结合活性和ET-1蛋白表达的影响，试图揭示替米沙坦逆转心肌肥厚的ARB以外的新机制。1材料与方法1.1实验动物健康SD大鼠，雌雄不拘，体重180230 g，均购自第三军医大学附属大坪医院动物中心。1.2主要试剂ET-1免疫组化试剂盒、DAB显色剂、P32试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。ET-GATA双链寡核苷酸购于上海基康公司。替米沙坦(商品名：美卡素)由德国Boehringer Ingelheim公司提供。主要仪器：超低温冰箱SANY(日本);显微摄影装置CKC-TR-ILA(日本NIKCON公司);垂直板电泳槽 DDY-3(北京六一仪

14、器厂);凝胶成像分析系统(美国Pharmacia biotech公司)。1.3动物模型的制备健康SD大鼠24只，随机数字法抽取大鼠分为假手术组(n=8);手术组(n=8)及替米沙坦组(n=8)。手术组采用腹主动脉缩窄法1建立心肌肥厚模型，假手术组只行开腹后腹主动脉穿线，未结扎。术后连续3 d青霉素抗感染，密切观察各组动物反应。替米沙坦组于术后第7天给予每只大鼠3 mg·kg-1·d-1替米沙坦2，药粉溶于少量蒸馏水中制成悬液，灌胃法给药，每日定时给药一次。另两组大鼠用等量生理盐水灌胃，共4 w。1.4血流动力学指标、心脏重量指数和心肌细胞横径(DC)的测定各组动物在观察期满

15、后用10%的乌拉坦(0.7 g/kg)腹腔麻醉，导管内充满肝素，右颈总动脉逆行插管至左心室，另一端接压力换能器输入多媒体生物信号记录仪系统，记录血流动力学指标：主动脉收缩压(SBP)、主动脉舒张压(DBP)和主动脉平均压(MBP)。随后立即开胸取出心脏，滤纸吸干后称心脏重量(HW)，再取左心室(包括室间隔)并称重(LVW)，计算左心室质量指数(LVMI)。石蜡包埋部分左心室游离壁心肌，制作病理切片。在HE染色切片上使用测微计测量DC，每张切片测量20个心肌细胞，取其均值。1.5心肌组织ET-1蛋白表达和GATA DNA结合活性的检测取另部分左心室游离壁心肌，采用免疫组化SABC法，DAB棕黄色

16、反应呈色检测心肌组织ET-1蛋白表达，采用电子迁移率变动分析(EMSA)法检测心肌组织GATA与ET启动子结合的特异性及GATA DNA结合活性。1.6统计学处理运用SPSS11.5统计软件，数据均以x±s表示。多组间比较采用组间方差分析，多组间两两比较采用q检验，各指标相互关系采用相关性分析。     11-01-11 11:30:00     编辑：studa202结果2.1各组大鼠血流动力学指标、LVMI和DC的变化 实验动物腹主动脉缩窄后5 w，大鼠左心室各壁明显增厚，左心室重量增加，心肌细胞体积

17、增大，心肌纤维排列紊乱，小血管壁增厚，间质增生，间质中有炎性细胞浸润，但左心腔大小无改变。手术组较假手术组SBP、DBP、MBP、LVMI、DC显著增高(P<0.01，P<0.05)，替米沙坦组较手术组SBP、MBP、LVMI、DC分别降低11.60%、9.30%、7.45%和16.39%。各组动物血流动力学指标、LVMI及DC，见表1和图1。2.2各组大鼠心肌组织ET-1蛋白表达的变化经SABC免疫组化，DAB显色法见大鼠心肌细胞质及细胞膜染成棕黄色，假手术组呈弱阳性表达(0.10±0.02)，手术组呈强阳性表达(0.14±0.03)，替米沙坦组呈阳性表达(0

18、.11±0.02)。见图2。表1各组大鼠血流动力学指标、LVMI及DC 的变化图1各组左室心肌结构比较(HE，×400)图2各组大鼠心肌ET-1蛋白表达(DAB，×400)2.3心肌组织ET-1蛋白表达与LVMI和DC的关系手术组心肌组织ET-1蛋白表达与LVMI和DC均呈显著正相关(r=0.899及0.895，P均<0.01)。2.4各组大鼠心肌组织GATA DNA结合活性的变化当加入特异性竞争性抑制剂时(100倍与寡核苷酸探针序列完全相同的非标记的双链寡核苷酸ET-GATA)，凝胶电泳条带消失，而加入100倍与特异序列无关的未标记的双链寡核苷酸(mut

19、ET-GATA)时，电泳特异性结合条带无明显变化。与假手术组比较(37.52±4.79)，手术组GATA DNA结合活性显著增加(77.06±8.11)(P<0.01)，与手术组比较，替米沙坦组GATA DNA结合活性显著降低(39.16±4.81)(P<0.01)。3讨论有研究显示大鼠压力负荷增加8 d时，心肌局部ET及心肌细胞ET mRNA表达升高3。在心肌细胞培养液中加入ET可直接促使心肌细胞肥大，而加入ET受体拮抗剂Bosentan能阻止血流动力学超负荷引起的心肌肥厚4。本研究也发现手术组大鼠心肌组织ET-1蛋白表达显著增高，提示大鼠压力超负荷

20、5 w心肌肥厚时心肌细胞分泌ET-1增加，心肌组织ET-1的升高与LVMI和DC呈显著正相关，表明ET-1参与了压力超负荷大鼠心肌肥厚的发生发展。GATA转录因子是与W/GATA/R序列结合的转录因子，普遍位于启动子、转录起始部位的上游或接近启动子的部位5。GATA转录因子在心脏的生长发育中起着重要作用。GATA5转录因子在大鼠妊娠中期胚胎的心脏中大量转录6，GATA4缺乏诱导心脏的结构缺陷导致大鼠在胚胎的第8天和第9天死亡7。本研究提示ET启动子中的GATA成分和核蛋白提取物中的GATA蛋白发生了特异性结合，即GATA转录因子参与了ET基因表达的调控。本研究还发现心肌肥厚时GATA DNA结

21、合活性增加，提示GATA转录因子可能通过结合活性的加参与心肌肥厚时ET-1表达的调控，使ET-1表达上调，这与国外报道一致4。替米沙坦具有高度的AT1受体亲和力，能从受体水平阻断血管紧张素(Ang)的心血管效应。本研究表明，替米沙坦能降低心肌组织ET-1的表达，其确切机制不明，推测其可能的机制有：替米沙坦通过拮抗AT1受体抑制ET-1的合成。利用体外培养的血管平滑肌细胞8、内皮细胞9进行实验均已证明Ang能够刺激ET-1的合成。Ang诱发的大鼠高血压，其血压可完全被AT1受体阻滞剂降至正常，同时组织中的ET含量也降至正常，间接支持Ang可能刺激ET的合成10。替米沙坦降低血压，改善血管内皮功能

22、，内皮细胞产生和释放到组织中的ET含量减少。目前尚未见替米沙坦通过降低GATA DNA结合活性而下调ET-1表达阻止心肌肥厚、改善心室重构的报道。本研究提示替米沙坦能抑制心肌肥厚和逆转心室重构，其机制可能与降低GATADNA结合活性从而下调ET-1表达有关。【参考文献】  1胡永梅，李法琦，罗羽慧，等.腹主动脉缩窄大鼠模型制作及临床意义J.重庆医科大学学报，2004;29(3):322-4.2Bohm M，Lee M，Kreutz R,et al.Angiotensin receptor blockade in TGR(mREN2)27：effects of renin-angiot

23、ensin-system gene expression and cardiovascular functionsJ.J Hypertens，1995;13(7):891-9.3Ito H，Hiroe M，Hirata Y,et al.Endothelin ETA receptor antagonist blocks cardiac hypertrophy provoked by hemodynamic overloadJ. Circulation，1994;89(5):2198-203.4Morimoto T，Hasegawa K，Kaburagi S,et al.Phosphorylati

24、on of GATA4 Is Involved in 1-Adrenergic Agonist-responsive Transcription of the Endothelin-1 Genein Cardiac MyocytesJ.J Biol Chem，2000;275(18):13721-6.5李扬秋.转录因子GATA的发现及其在造血系统的研究进展J.国外医学·输血及血液分册，1996;19(3):154-7.6Reiter JF，Alexander J，Rodaway A,et al.GATA5 is required for the development of the

25、heart and endoderm in ZebrafishJ.Genes Dev，1999;13(22):2983-95.7Molkentin JD，Lin Q，Duncan SA,et al.Requirement of the transcription factor GATA4 for heart tube formation and ventral morphogenesisJ. Genes Dev，1997;11(8):1061-72.8Imai T，Hirata Y，Emori T，et al.Induction of endothelin-1 gene by angioten

26、sin and vasopreain in endothelial cellsJ.Hypertension，1992;19(6 Pt 2):753-7.9Bakris GL，Re RN.Endothelin modulates angiotensin -induced mitogenesis of human mesangial cellsJ.Am J Physiol，1993;264(6 Pt 2):F937-42.10Dohi Y，Hahn AW，Boulanger CM,et al.Endothelin stimulated by angiotensin augments contrac

27、tility of spontaneously hypertensive rat resistance arteriesJ.Hypertension，1999;19(2):131-7.     11-01-11 11:30:00     编辑：studa202结果2.1各组大鼠血流动力学指标、LVMI和DC的变化 实验动物腹主动脉缩窄后5 w，大鼠左心室各壁明显增厚，左心室重量增加，心肌细胞体积增大，心肌纤维排列紊乱，小血管壁增厚，间质增生，间质中有炎性细胞浸润，但左心腔大小无改变。手术组较假手术组SBP、DBP、

28、MBP、LVMI、DC显著增高(P<0.01，P<0.05)，替米沙坦组较手术组SBP、MBP、LVMI、DC分别降低11.60%、9.30%、7.45%和16.39%。各组动物血流动力学指标、LVMI及DC，见表1和图1。2.2各组大鼠心肌组织ET-1蛋白表达的变化经SABC免疫组化，DAB显色法见大鼠心肌细胞质及细胞膜染成棕黄色，假手术组呈弱阳性表达(0.10±0.02)，手术组呈强阳性表达(0.14±0.03)，替米沙坦组呈阳性表达(0.11±0.02)。见图2。表1各组大鼠血流动力学指标、LVMI及DC 的变化图1各组左室心肌结构比较(HE，&

29、#215;400)图2各组大鼠心肌ET-1蛋白表达(DAB，×400)2.3心肌组织ET-1蛋白表达与LVMI和DC的关系手术组心肌组织ET-1蛋白表达与LVMI和DC均呈显著正相关(r=0.899及0.895，P均<0.01)。2.4各组大鼠心肌组织GATA DNA结合活性的变化当加入特异性竞争性抑制剂时(100倍与寡核苷酸探针序列完全相同的非标记的双链寡核苷酸ET-GATA)，凝胶电泳条带消失，而加入100倍与特异序列无关的未标记的双链寡核苷酸(mut ET-GATA)时，电泳特异性结合条带无明显变化。与假手术组比较(37.52±4.79)，手术组GATA DNA

30、结合活性显著增加(77.06±8.11)(P<0.01)，与手术组比较，替米沙坦组GATA DNA结合活性显著降低(39.16±4.81)(P<0.01)。3讨论有研究显示大鼠压力负荷增加8 d时，心肌局部ET及心肌细胞ET mRNA表达升高3。在心肌细胞培养液中加入ET可直接促使心肌细胞肥大，而加入ET受体拮抗剂Bosentan能阻止血流动力学超负荷引起的心肌肥厚4。本研究也发现手术组大鼠心肌组织ET-1蛋白表达显著增高，提示大鼠压力超负荷5 w心肌肥厚时心肌细胞分泌ET-1增加，心肌组织ET-1的升高与LVMI和DC呈显著正相关，表明ET-1参与了压力超负荷

31、大鼠心肌肥厚的发生发展。GATA转录因子是与W/GATA/R序列结合的转录因子，普遍位于启动子、转录起始部位的上游或接近启动子的部位5。GATA转录因子在心脏的生长发育中起着重要作用。GATA5转录因子在大鼠妊娠中期胚胎的心脏中大量转录6，GATA4缺乏诱导心脏的结构缺陷导致大鼠在胚胎的第8天和第9天死亡7。本研究提示ET启动子中的GATA成分和核蛋白提取物中的GATA蛋白发生了特异性结合，即GATA转录因子参与了ET基因表达的调控。本研究还发现心肌肥厚时GATA DNA结合活性增加，提示GATA转录因子可能通过结合活性的加参与心肌肥厚时ET-1表达的调控，使ET-1表达上调，这与国外报道一致

32、4。替米沙坦具有高度的AT1受体亲和力，能从受体水平阻断血管紧张素(Ang)的心血管效应。本研究表明，替米沙坦能降低心肌组织ET-1的表达，其确切机制不明，推测其可能的机制有：替米沙坦通过拮抗AT1受体抑制ET-1的合成。利用体外培养的血管平滑肌细胞8、内皮细胞9进行实验均已证明Ang能够刺激ET-1的合成。Ang诱发的大鼠高血压，其血压可完全被AT1受体阻滞剂降至正常，同时组织中的ET含量也降至正常，间接支持Ang可能刺激ET的合成10。替米沙坦降低血压，改善血管内皮功能，内皮细胞产生和释放到组织中的ET含量减少。目前尚未见替米沙坦通过降低GATA DNA结合活性而下调ET-1表达阻止心肌肥

33、厚、改善心室重构的报道。本研究提示替米沙坦能抑制心肌肥厚和逆转心室重构，其机制可能与降低GATADNA结合活性从而下调ET-1表达有关。【参考文献】  1胡永梅，李法琦，罗羽慧，等.腹主动脉缩窄大鼠模型制作及临床意义J.重庆医科大学学报，2004;29(3):322-4.2Bohm M，Lee M，Kreutz R,et al.Angiotensin receptor blockade in TGR(mREN2)27：effects of renin-angiotensin-system gene expression and cardiovascular functionsJ.J Hypertens，1995;13(7):891-9.3Ito H，Hiroe M，Hirata Y,et al.Endothelin ETA receptor antagonist blocks cardiac hypertrophy