抗氧化活性检测方法的研究进展.天然产物研究与开发 2008

1、天然产物研究与开发N at Prod R es D ev 2008,20:5632567文章编号:100126880(20080320563205收稿日期:2007207220接受日期:2007209229基金项目:国家“十五”科技攻关重大专项(2002BA518A083通讯作者E 2mail:zdliu1976抗氧化活性检测方法的研究进展刘志东1,郭本恒23,王荫榆21上海水产大学食品学院,上海200090;2光明乳业技术中心,上海200072摘要:本文综述了常用的抗氧化活性检测方法,讨论了各种方法的优缺点。关键词:抗氧化剂;抗氧化活性;检测方法中图分类号:R285;TS203.3文献标识码

2、:AM ethods to D eterm i n e An ti ox i da ti ve Acti v ityL IU Zhi 2dong 1,G UO Ben 2heng 23,WANG Yin 2yu21College of Food Science and Technology,Shanghai F isheries U niversity,Shanghai 200090,China;2Technical Center ,B right D airy Co .,L td .,Shanghai 200072,ChinaAbstract:The analytical methods r

3、ecently used f or anti oxidant activity were revie wed .The advantages and disadvantages of these methods were discussed .Key words:anti oxidant;anti oxidant activity;analytical method基于不同原理的各种体外抗氧化活性检测方法已广泛用于抗氧化剂的检测,这些方法虽然能够在不同的条件下反映抗氧化剂的多种功能特性,但也各有其局限性。本文对常用的抗氧化活性检测方法进行了综述。抗氧化活性的检测模式主要有:(1测量底物(标记底

4、物或产物的量的变化;(2测量氧化反应的速率;(3测量特征自由基变化的速度或程度;(4测量被测物的抑制率,I C 50和TEC 50;(5测量被测物产生与标准抗氧化剂同等作用的浓度1。目前常用的抗氧化活性检测方法主要基于以下机理:(1在特定条件下,样品对检测体系中脂类物质的氧化抑制能力反映被测物的抗氧化活性;(2在特定条件下,样品对检测体系中自由基的清除能力反映被测物的抗氧化活性;(3在特定条件下,测定样品的还原能力反映被测物的抗氧化活性。1自由基清除能力的检测方法自由基的清除是抗氧化剂发挥抗氧化作用的主要机制。自由基的清除能力是通过检测在简化的“无脂”体系中潜在的抗氧化剂提供的氢或者电子向自由

5、基迁移的能力。稳定的色原体自由基(如DPPH 在有机体系中已被广泛用于抗氧化活性的检测。这些方法可能在筛选抗氧化剂方面是有用的。但是对于生物体系而言,这些稳定的自由基同不稳定的自由基相比而言是外来的,如在氧化过程中中间反应产生的羟基自由基和过氧化自由基2。1.1ABTS 自由基的清除能力(ABTS:2,22az i n o 2b is 2(32ethylbenzoth i a zoli n e 262sulphon i c ac i dABTS 由过硫酸铵氧化作用产生的单阳离子自由基ABTS +,可以在734n m 的最大吸收峰处形成一个蓝/绿发色团3。抗氧化剂加入到预先形成的ABTS+中,在

6、一段时间后,ABTS +变为ABTS,这主要取决于样品的抗氧化活性和浓度,以734nm 处的吸光度来表示褪色的程度,以百分率(%表示ABTS+的抑制率426。为了便于比较不同抗氧化剂的活性,采用TEAC (Tr ol ox Equivalent anti oxidant Capacity 为活性单位,定义为1mmol/L 某种抗氧化剂相当于tr ol ox 的浓度(mmol/L 。该法简便,快速,适合于大量样品的检测。ABTS+在与氢原子供体的反应中选择性差是此法的一个不足,它可与任何羟基化的芳香族化合物反应,这与它们的实际抗氧化能力关,因此,TE AC 值也包括对抗氧化不起作用的羟基。H 2

7、O e -aq +OH +He -aq +N 2O +H 2O OH +N 2+OH-N-3+OHN3+OH-N3+ABTS22ABTS2+N-3ABTS2+ScavengerScavenger+ABTS22 1.2DPPH自由基的清除能力DPPH法是20世纪50年代发明的,最初用于研究食物中的供氢体,后来广泛用于定量测定生物试样、酚类物质和食品的抗氧化能力。DPPH(二苯代苦味酰基自由基在有机溶剂中是一种稳定的自由基,该法根据DPPH在517n m处有强吸收和其乙醇溶液呈紫色的性质。当抗氧化剂存在时,由于与其孤对电子配对而吸收消失或减弱,可以通过计算EC50,TEC50(清除DDPH50%时

8、所用的时间和AE(清除效率等参数来反映抗氧化剂清除自由基的能力7。DPPH法是评价天然抗氧化剂抗氧化活性的一种快速,简便,灵敏的方法。DPPH法又可分为动力学法和静力学法2种。动力学方法检测的是添加含有供氢能力的样品后DPPH减弱的速率,表征的是被测物的反应速率,一般用DPPH减弱的起始速率表示;静力学方法检测的是被测物清除DPPH的量,或DPPH与某一供氢体反应的化学计量关系或复杂混合物中活性OH的量,多以I C50表示8,9。该法的主要缺陷是DPPH自由基会与其他自由基(如烷氧自由基发生反应,且自由基反应达到稳定状态的时间与抗氧化剂和DPPH的浓度比不成线性关系10。1.3羟基自由基的清除

9、能力羟基自由基(OH是一种能够激发油脂过氧化反应的较强的氧化剂,可以采用脱氧核糖法间接地测量。这种方法通过确定抑制自由基形成的百分率或者计算由羟基自由基诱导的反应速率常数来表示。相对而言,从试管反应中获得的结果比复杂的方法获得的结果更加简单。这种方法的原理是2脱氧2D2核糖降解产生的羟基自由基诱导引发Fen2 t on反应。酸性条件下加热后产生的二次氧化产物MDA,1分子的丙二醛(MDA与2分子的硫代巴比妥酸(T BA作用形成粉红色的色原体,该有色化合物在532n m处有吸收。因此,可以通过测定MDA的量来评价体系的氧化程度。Fe2+EDT A+O2Fe3+E DT A+O2(12O22+2H

10、H2O2+O2(2Fe2+EDT A+H2O2OH2+OH+Fe3+E D2 T A(3OH+脱氧核糖片断heat&acidMDA(42T BA+MDA色原体(5脱氧核糖与铁在E DT A存在的条件下会导致羟基自由基(OH的形成,因此加速糖的氧化。这个反应被认为是非特定位点的结合试验,存在的抗氧化剂与生成的羟基结合而不是直接与脱氧核糖结合。另一方面,如果用相同体积的磷酸盐缓冲液代替EDT A,可以反映出待测抗氧化剂为了与铁相互竞争而在特定位点与脱氧核糖结合。这两种方法都是通过测定532nm处脱氧核糖降解减少的量来表示11,12。1.4超氧阴离子自由基的清除能力(O2虽然超氧阴离子自由基

11、(O22不能直接诱导生物和食品体系中的脂类氧化,但它会在金属离子催化下发生Fent on反应产生有高活性的OH,因此常用样品对超氧阴离子自由基(O22的清除能力来反映其抗氧化活性。1.5氧自由基的清除能力(ORAC该法采用2藻红蛋白(2phycoerythrin,2PE作为指示蛋白,以偶氮化合物AAPH、Cu2+2H2O2体系产生的Fent on反应或者过渡金属离子Cu2+分别作为脂过氧化自由基(LOO和羟基自由基(OH的来源,VE水溶性类似物Tr ol ox作为参照标准,2 PE受到自由基攻击时,在一定的波长下荧光度不断衰减,而具有自由基清除能力的样品可以保护它免受攻击,根据PE荧光强度衰减

12、曲线下的面积变化计算出样品的自由基清除能力。由于本方法采用不同自由基发生物,因此可以检测样品对不同自由基的清除能力13。结果计算应采用衰减曲线下的面积,所以应综合考虑样品清除自由基过程中作用时间与作用强度两方面的因素,使结果表达更全面,科学。由于2PE的荧光具有不稳定性,暴露在激发波长下会很快自发衰退,使其难以进行定量计算。加之分离得到的PE的纯度限制,很难保证不同结果之间的可比性。后来,以荧光素(F L作为荧光探针进行了改进,使其适用于常规的荧光平板阅读器, ORAC方法得到了快速的发展和广泛的应用14。1.6总自由基捕获抗氧化参数法(T RAP该法是由W ayner,Burt on,I n

13、gold,et al(1985年发明,该法采用2,22偶氮(22脒基丙烷(ABAP作过氧化物自由基的来源,氧浓度的降低常被用来评价氧化的速率。这种方法也已经通过采用其他的自由基来源和技术监测过程而得以改变15。采用AAPH为自由基来源时,AAPH可以分解465天然产物研究与开发Vol120成以C2为中心的自由基,然后自由基与氧反应生成过氧自由基(RO2:RN=RNN2+2RR+O2=RO2RO2自由基与被检测的抗氧化剂反应,只有抗氧化剂全部被消耗后,RO2才攻击体系中的脂肪(这部分脂肪是体系自有的或加入的,使脂肪过氧化。抗氧化活性大小用Tr ol ox当量(TE AC来表示。1.7DMP D+

14、法该法由Fogliano等提出:在酸性条件下,DMP D (N,N2di m ethyl2p2phenylenedia m ine可被ABAP、FeCl3、CuCl2、H2O2氧化而生成稳定的DMP D+,它在505nm处有最大吸收峰,抗氧化活性大小用Tr ol ox当量(TEAC来表示16。根据加入抗氧化剂后吸光度的变化可测得样品清除自由基的能力。DMP D只溶于水,不能用于疏水性抗氧化剂的测定。2脂质体系抗氧化能力的检测方法脂质过氧化(li p id per oxidati on,简称LP O是指脂类(LH的多不饱和脂肪酸(P UF A在自由基的引发下经酶促或非酶促作用,使其发生过氧化而生

15、成脂质过氧化物的过程。脂质的过氧化过程与生物体正常结构的紊乱和膜功能损伤有关。脂质的氧化也称脂质的过氧化,主要有3种类型:自由基氧化,酶氧化和非自由基非酶促氧化。最重要的氧化反应是由自由基引发的链式反应,也称自动氧化,其典型途径包括链的引发、增长和终止。脂质体系抗氧化能力检测中常用的被氧化底物和体系主要有:油脂或富含油脂的食物,油酸、甲基亚油酸,低密度脂蛋白(LDL和高密度脂蛋白(HDL10,17219;检测体系主要有:有机溶剂或(水胶束和反胶束体系、乳化体系,脂质体和微粒体。脂质体系抗氧化能力的检测方法主要分为两类:脂质氧化初期产物的检测:过氧化值法(P OV,共轭二烯氢过氧化物法和硫氰酸铁

16、法(FT C;脂质氧化终产物的检测:硫代巴比妥酸法(T BARS、顶空气相色谱法,茴香胺值法和羰基值法。每种方法都各有其有优缺点,实际检测时应综合考虑1。脂质体系中氧化反应抑制或中止的判断主要通过测量被氧化物的浓度,氧的去除或氧化产物的形成。因此,反应物(氧,不饱和脂肪酸,自由基等的消失,氧化产物的定量可能是判断氧化阶段的最合适方法。通过直接或者间接检测氧的消失和自由基的电子自旋光谱,适用于氧化过程的初始阶段20。通常采用T BARS法来评价脂质的过氧化。T BARS 法是根据脂类发生过氧化反应过程中形成的丙二醛(MDA的量来表示。研究表明p r obucol及其同系物能够阻止LDL在体外的氧

17、化和减弱动脉硬化的形成。该法适用范围很广,它不仅能够检测MDA 的含量,而且还能够检测其他的含氧化合物21224。通常所用的脂质体是由大豆卵磷脂溶于磷酸盐缓冲液而形成,可以用来检测由游离的过渡金属离子或自由基引发的氧化。当磷脂分散在水中就能自发地形成脂质体;球形粒子被认为是由一个或多个磷脂双分子层围绕水泡形成。氧化程度通过测定234n m处由脂氢过氧化物、脂醇和脂肪酸生成的共轭二烯烃产物的吸光值来表示。也可以通过添加亚铁离子或者由AAPH热分解产生的过氧化自由基诱发脂质体发生氧化。AAPH热分解后,与邻近的底物反应产生连续的过氧化氢自由基并从底物如油脂获得氢原子以产生新的活性氧。最后,这个反应

18、引发的自由基链式反应导致了油脂的败坏。该反应体系应在37条件下保持100m in并每隔4m in测量一次。通过与对照组相比,测定过氧化反应速度的变化来表示其抗氧化能力25。但是脂质体系抗氧化能力检测方法的还存在一定的不足,主要包括:(1抗氧化剂在水相和油相间的分配效应;(2被氧化底物的性质和组成(如脂质不饱和程度,脂肪的物理化学状态等;(3诱导氧化反应的方式(如升高温度、各种催化剂或自由基引发剂的的添加,增大氧压以及搅拌等3抗氧化剂还原能力的检测方法3.1铁离子还原能力(FRAPFRAP的原理是基于氧化还原反应的比色法。在酸性条件下,Fe3+2TPT A(Fe3+2三吡啶三嗪被抗氧化剂还原成F

19、e2+2TPTZF,溶液变成深蓝色,并且在593n m处有强吸收。FRAP法具有快速、简便、重复性好等优点。该法不仅用于检测食物及饮料的抗氧化活性,也可用于检测纯天然抗氧化剂的活性26。3.2循环伏安法循环伏安法(cyclic volta mmetry,CV主要用于测定分子之间发生的电子转移。近来Kohen等人用CV法评价生物体液或组织匀浆液中低分子量抗氧565Vol120刘志东等:抗氧化活性检测方法的研究进展化剂的总还原能力。CV法测得的是复杂混合物总的抗氧化能力,不能测定复杂混合物中的单一抗氧化剂。CV法不可逆,敏感度较低,但是结果可靠,重复性好,适于比较研究27。4讨论目前,虽然有多种抗

20、氧化活性的检测方法,由于抗氧化反应的多样性和复杂性,尚未形成一种标准方法。抗氧化剂在体系中的抗氧化活性受很多因素的影响,主要有抗氧化剂在水相和油相间的分配效应、所处的微环境、被氧化底物的性质和组成,检测体系(均相体系和胶束乳化体系、生物膜体系及复合抗氧化剂体系等复杂体系。因此,在进行抗氧化活性实验设计时,这些因素都要被考虑。对于具体某一被测物的抗氧化活性,应至少使用两种不同的方法,因为被测物在一种检测方法中是抗氧化剂,而在另一种方法中有可能是促氧化剂10。因此,在检测被测物的抗氧化活性时,首先,应明确氧化作用的底物是脂类物质、蛋白质还是DNA28。其次,不要对样品的抗氧化效果轻易下结论,除非实

21、验条件与应用环境条件基本相同。此外,由于相互作用物质的存在状态,检测方法的原理和检测结果表达的方式不同等原因,造成了结果之间互相比较的困难,甚至一些结果是互相矛盾的。这主要是由于:(1各种抗氧化活性检测方法的原理和目的不同,如TE AC法和ORAC法反映的是抗氧化剂抑制体系中自由基引起的氧化还原反应能力,而FRAP法反映的是被测物的还原能力。(2天然抗氧化剂和生物样品一般是混合物,其中每一种物质对不同测量方法有不同的贡献。例如,尿酸对总的FRAP法的贡献占60%,而GSH对这种方法几乎没有任何影响。(3不同抗氧化活性结果的表示方式不同,如ORAC法表示的是样品中2 PE的过氧化动力学,而TE

22、AC法则表示的是特定时间内(3或6m in测量到的被测抗氧化剂29。还需要指出的是这些方法都是在非生理条件下进行的。因此,这些结果是不能外推为体内的结果。因此,较好的方法是采用细胞学实验和体内外实验相结合的方法综合评价样品的抗氧化活性30。抗氧化活性的检测方法与被测物的性质,组成和检测体系等因素密切相关,深入了解不同抗氧化活性检测方法的原理,优缺点和它们之间的关系,以及不同条件下对样品抗氧化活性的检测能力,对于全面,真实地了解抗氧化剂的活性具有重要的意义。参考文献1W ang H(王会,Guo L(郭立,Xie WL(谢文磊.Meth2 ods f or deter m ining anti

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