细菌基因组DNA的提取ppt课件

1、实验：细菌基因组实验：细菌基因组DNADNA的提取的提取 116229 于 妍116230116220 杜 辉116222 主讲人：1;.目录目录一、实验目的二、实验原理三、仪器、试剂四、实验方法和步骤五、实验本卷须知六、DNA提取常见问题七、问题与讨论2;.一、实验目的一、实验目的学会细菌基因组DNA的提取方法察看提取出来的DNA物质3;.二、实验原理二、实验原理 DNA DNA在生物体内是与蛋白质构成复合物的方式存在，因此提取出脱氧核糖核蛋白复在生物体内是与蛋白质构成复合物的方式存在，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必需将其中蛋白质去除。在碱性条件下，用外表活性剂合物后，必需将其中蛋白质

2、去除。在碱性条件下，用外表活性剂SDSSDS将细菌细胞将细菌细胞壁破裂，然后用高浓度的壁破裂，然后用高浓度的NaClNaCl沉淀蛋白质杂质，经过氯仿抽提进一步去掉蛋白质沉淀蛋白质杂质，经过氯仿抽提进一步去掉蛋白质等杂质，经乙醇沉淀，得到较纯的等杂质，经乙醇沉淀，得到较纯的DNADNA。4;.三、仪器、试剂三、仪器、试剂1、仪器 离心管、离心机、试管、吸量管2、试剂1活资料：大肠杆菌E.coli或枯草杆菌Bacillus subtilis2培育基：LB液体培育基3溶菌酶：100g/ml4裂解液：40mmol/Ltris-HCl,pH8.0,20mmol/L乙酸钠，1mol/LEDTA，1%SDS

3、5;.51%SDS十二烷基硫酸钠：1gSDS溶于100ml 蒸馏水，灭菌后-4保管6mol/LNaCl：称取292.5gNaCl，溶于1000ml蒸馏水，灭 菌后-4保管。7无水乙醇及70%乙醇8超纯水9TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl， 1mmol/LEDTA-Na2pH：8.010饱和酚11氯仿：异戊醇25：16;.四、实验方法和步骤四、实验方法和步骤1、DNA提取的普通方法破碎细胞破碎细胞提取提取纯化纯化I. I.资料预备资料预备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分别、纯化核酸分别、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀

4、或吸附核酸，并去除杂质 V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中7;.四、实验方法和步骤四、实验方法和步骤2、DNA提取的实验步骤菌体培育菌体培育37 37 、1618h1618h菌体搜集菌体搜集12000r/min、30sNaCl充分混匀充分混匀12000r/min12000r/min，10min10min弃上清液弃上清液200L裂解缓冲液裂解缓冲液转移上清置新离心转移上清置新离心管管加加Tris饱和苯酚饱和苯酚混匀混匀12000rmin12000rmin，3min3min取水层加氯仿取水层加氯仿混匀混匀12000r/min12000r/min、3min3min取上层清液

5、加无水乙取上层清液加无水乙醇醇12000r/min12000r/min、3min3min弃上清弃上清沉淀加沉淀加400L400L70%70%乙醇乙醇洗两次洗两次真空枯燥真空枯燥溶解溶解DNADNA-20 -20 冰箱冰箱8;.五、实验本卷须知五、实验本卷须知1 1、资料应适量，过多会影响裂解，导致、资料应适量，过多会影响裂解，导致DNADNA量少，纯度低。量少，纯度低。2 2、采用有机酚、采用有机酚/ /氯仿抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。氯仿抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。3 3、离心分别两相时，应保证一定的转速和时间。、离心分别两相时，应保证一定的转速和时间。4 4、沉淀后运用、沉淀后运用

6、7070的乙醇洗涤，以除去盐离子等。的乙醇洗涤，以除去盐离子等。5 5、晾干、晾干DNADNA，让乙醇充分挥发不要过分枯燥。，让乙醇充分挥发不要过分枯燥。9;.1 1、DNADNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2 2、DNADNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反响制后续酶解反响3 3、DNADNA中残留有金属离子中残留有金属离子1 1、重新纯化、重新纯化DNADNA，去除蛋白、多糖、多，去除蛋白、多糖、多酚等杂质酚等杂质2 2、重新沉淀、重新沉淀DNADNA，让酒精充分挥发，让酒精充分挥发3 3、添加、添加7070乙醇洗涤的次数乙醇

7、洗涤的次数2-32-3次次六、六、DNA提取常见问题提取常见问题问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反响反响原原 因因对对策策10;.111 1、资料不新颖或反复冻融、资料不新颖或反复冻融2 2、未很好抑制内源核酸酶的活性、未很好抑制内源核酸酶的活性3 3、提取过程操作过于猛烈，、提取过程操作过于猛烈，DNADNA被机械打断被机械打断4 4、外源核酸酶污染、外源核酸酶污染5 5、反复冻融、反复冻融问题二：问题二：DNADNA降解降解对对策策 缘由缘由1 1、尽量取新颖资料，低温保管资料防止反复、尽量取新颖资料，低温保管资料防止反复冻融冻融2

8、2、液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前参与、液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前参与裂解缓冲液裂解缓冲液3 3、在提取内源核酸酶含量丰富的资料的、在提取内源核酸酶含量丰富的资料的DNADNA时，可添加裂解液中螯合剂的含量时，可添加裂解液中螯合剂的含量4 4、细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔、细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5 5、一切试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌、一切试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6 6、将、将DNADNA分装保管于缓冲液中，防止反复冻分装保管于缓冲液中，防止反复冻融融;.1 1、简要表达酚氯仿抽提体系后出现的景象及其成因。、简要表达酚氯仿抽提体系后出现的景象及其成因。 酚氯仿抽提酚氯仿抽提DNADNA后，会使溶液分层，上层为水相，含有后，会使溶液分层，上层为水相，含有DNADNA；中间为蛋白有时看不到；下层为有机相。缘由是酚；中间为蛋白有时看不到；下层为有机相。缘由是酚氯仿可以使蛋白量变性，从而从溶液中析出，但是蛋白密度氯仿可以使蛋白量变性，从而从溶液中析出，但是蛋白密度会小于酚氯仿，所以离心后它分布在中间；而会小于酚氯仿，所以离心后它分布在中间；而DNADNA溶于水而不溶于水而不溶于有机相。溶于有机相。2 2、沉淀时为什么要用无水乙醇？、沉淀时为什么要用无水乙醇？ 是由于是由于DNADNA不溶于乙醇，