环孢素A联合雷公藤单体T4对人系膜细胞增殖及其表达、合成白细胞介素-6的影响

1、    环孢素A联合雷公藤单体T4对人系膜细胞增殖及其表达、合成白细胞介素-6的影响        的探讨环孢素A(CsA)和雷公藤单体T4(T4)的免疫抑制机制以及两药联合使用的效应，特别是小剂量CsA、T4联合获得较强免疫抑制效应的可能性。方法用3H-TdR掺入率法测定人系膜细胞(MsC)增殖，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和ELISA法测定细胞IL-6mRNA表达及培养上清IL-6含量。结果CsA和T4均剂量依赖性抑制系膜细胞增殖及IL-6合成，两药联合产生明显

2、的协同作用，小剂量CsA、T4联合与大剂量CsA作用相当。结论CsA和T4具有协同免疫抑制作用。关键词环孢素A雷公藤单体T4系膜细胞白细胞介素-6Effects of CsA combined with T4 on cultured human mesangial cell proliferationand its expression and synthesis ofinterleukin-6Su Ying,Li Xuewang,Gao Yang,et al.Department of Nephrology,Peking Union Medical Collage Hospital,Beij

3、ing 100730ObjectiveTo investigate the mechanisms of immunosuppression of CsA and T4 and effects of these two drugs used combinedly in lower dose.MethodsMsC proliferation was determined by 3 H-TdR incorporation.IL-6mRNA expression and protein synthesis were measured by RT-PCR and ELISA respectively.R

4、esultsBoth CsA and T4 inhibited MsC proliferation and IL-6 producion in a dose-dependent manner.Combination of two drugs produced an additional effect.A lowerdose of CsA associated with T4 could reach the same degree of immunosuppression as a higher dose of CsA does.ConclusionCombination of CsA and

5、T4 produces a synergistic immunosuppression.Key wordsCyclosporin ATripcholorlide(T4)Mesangial cellInterleukin-6长期以来，原发性肾病综合征的治疗始终是人们研究的重点。环孢素A治疗肾病综合征疗效很好，但它引起的肾小球硬化及弥漫性间质性纤维化限制了该药的广泛应用。这一毒副作用与用药剂量有关，因此我们设想能否通过减少CsA的剂量同时加上另一种免疫抑制剂以保持同样的免疫抑制功效而又降低了CsA的毒副作用。雷公藤氯内酯醇(T4)是雷公藤的主要活性成分之一，具有显著的抗炎、免疫抑制作用，相关效价比

6、雷公藤多甙强100200倍。我们采用不同剂量的CsA与T4单独或联合作用于体外培养的人系膜细胞，通过观察细胞增殖反应、IL-6mRNA表达及蛋白合成，进一步探讨药物作用的分子机制以及两药联合使用的效应，特别是小剂量CsA、T4联合获得较强免疫抑制效应的可能性 材料与方法一、试剂CsA由华北药厂提供，T4由中国医学科学院药研所惠赠，RPMI 1640干粉及胎牛血清为Gibco公司产品，L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、型胶原酶、胰蛋白酶、脂多糖为Sigma公司产品，IL-6 ELISA Kit购自Genzyme。人IL-6引物(342bp)：5CAAATTCGGTACATCCTCGAC 3，3GTCAGG

7、GGTGGTTATTGCATC5，人-actin引物(320bp)：5GCATGGAGTCCTGTGGCAT3，3GGTGGCGTTTACGAAGATC5，由中国医学科学院微生物研究所合成。二、方法(一)肾小球系膜细胞的原代及传代培养：取肾移植配型不合之正常肾脏，分离肾皮质，剪碎后转移到425m钢筛上碾压，再从重叠的180m及75m筛滤过，在75m筛面上收集肾小球。加入0.6mg/ml型胶原酶消化去除包曼囊。用含20%胎牛血清的完全培养液悬浮肾小球块，分装入塑料培养瓶中，于CO2恒温培养箱中孵育(37，5%CO2)，常规换液、传代。系膜细胞的鉴定采用相差显微镜、间接免疫荧光染色(抗FN、抗Co

8、ll、抗vimentin、抗actin阳性，抗cytokeratin阴性)、电镜及细胞收缩试验。本实验所用细胞均为传代36次的细胞。(二)不同浓度CsA联合雷公藤单体T4对系膜细胞增殖的影响：传代36次的MsC悬浮于20%FCS RPMI1640，种入96孔板，每孔3 000个细胞。分别加入不同浓度CsA和(或)T4，使终体积为200l/孔，每一浓度设6个复孔。培养48小时后，每孔加入18.5kBq3H-TdR，继续孵育24小时。用DYQ-型半自动细胞收获器将细胞收集于49型玻璃纤维滤纸上，干燥后置于POPOP+PPO闪烁液内，用LKB 1215液闪计数仪计数3H-TdR掺入值。去除药物的可逆

9、性实验：同上种植细胞并加入药物，孵育72小时。吸除含药物的培养上清，并于6小时内用20%FCS RPMI 1640洗涤细胞三次，继续培养48小时。每孔加入18.5kBq3H-TdR，孵育24小时，收获细胞，计数min-1值。(三)不同浓度CsA联合雷公藤单体T4对MsC IL-6分泌的影响：用5%FCS RPMI1640培养液将系膜细胞稀释至3×104个/ml，种入24孔培养板，每孔1ml。分别加入药物及LPS10g/ml，每组设三个复孔。孵育24小时后，留取培养上清，用IL-6 ELISA Kit测定上清中IL-6含量。孔底细胞加入无血清培养液及MTT孵育4小时，去上清，加入DMS

10、O溶解细胞，测定吸光度A490值。(四)CsA及T4对MsC IL-6mRNA表达的影响：1.药物作用于系膜细胞：将MsC悬浮于5%FCS RPMI1640中，混匀种入培养瓶，待细胞数约为2×106时，加入脂多糖(LPS)10g/ml(终浓度)及不同剂量CsA和T4，使每瓶细胞内药物的终浓度分别为：(1)CsA 1.0g/ml+T410ng/ml;(2)CsA 1.0g/ml;(3)CsA0.1g/ml+T4 0.625ng/ml;(4)T410ng/ml;(5)不加CsA及T4，继续孵育6小时，收获细胞。2.提取总RNA：在装有细胞的eppendorf管中加入0.5ml裂解液，匀浆

11、后，用50l 3mol/L乙酸钠(pH5.2)，500l水饱和酚和100l氯仿/异戊醇(491)抽提上层水相，加无水乙醇沉淀RNA。再用裂解液和无水乙醇提取一次。加70%乙醇淋洗除盐，离心，沉淀即为总RNA。3.逆转录反应(RT)：在沉淀有总RNA的各管中，分别加入0.1%焦磷酸二乙酯(DEPC)水12l，5×逆转录缓冲液4.0l，12.5mmol/L dNTP 1.5l，3引物50 pmol/l1.0l，混匀，65水浴5分钟，置冰浴，每管加入逆转录酶MMLV 300U，37保温60分钟。再于95水浴5分钟，以灭活逆转录酶。4.PCR反应：在0.5ml eppendorf管中分别加入

12、10×TaqDNA聚合酶buffer2.5l，2.5mmol/L dNTP 2.0l，5引物(10pmol/l)1.5l，3引物(10pmol/l)1.5l，逆转录产物2.0l，灭菌双蒸水14.5l，混匀，95水浴5分钟，置冰浴。加入2UTaq DNA聚合酶，混匀。在热循环仪上进行PCR反应，条件如下：94，40秒；64，1分钟；72，1分钟；循环35次；最后72延伸10分钟。5.电泳及照相。6.测定特异性条带的吸光度值：用激光密度扫描仪定量测定条带的面积A值，以-actin为内参照，计算相对单位。(五)统计学分析：结果以一次实验6个测定值的均数±标准差表示，组间比较用F检

13、验及q检验，P0.05有统计学意义。结果一、环孢素A联合雷公藤单体T4对人系膜细胞增殖的抑制作用表1为药物作用下各组细胞3H-TdR掺入值。统计学分析显示，不同浓度CsA组间有显著性差别，其中CsA 1.0g/ml组min-1值CsA 0.01g/ml组CsAg/ml组(P0.05)，表明CsA剂量依赖性抑制系膜细胞增殖。不同浓度T4组间也有显著性差异，T410ng/ml组T42.5ng/ml组T40.625ng/ml组T40组，P0.05，表明T4剂量依赖性抑制系膜细胞增殖。比较单加CsA和T4各组，T410ng/ml组min-1值为1232±164，CsA 1.0g/ml组为68

14、69±748，可见在本实验条件下，T4对增殖的抑制作用明显强于CsA，P0.05。两药联合产生明显的交互影响，即CsA与T4协同抑制系膜细胞增殖，P0.05。小剂量CsA联合T4时，CsA 0.1g/ml+T4 0.625ng/ml组值为6137±605，小于CSA1.0g/ml组6869±748，P0.05，表明小剂量CsA联合T4对增殖的抑制作用大于较大剂量CsA的单独作用。表1不同剂量CsA及(或)T4对MsC 3 H-TdR掺入率的影响T4(ng/ml)102.50.6250CsA1.0753±2352511±7915728±

15、7686869±748*(g/ml)0.11293±2644159±8926137±605*7829±10450.011312±4194556±4845865±7878255±127101232±1644743±3875909±6729680±1417注：每组数据为二次实验共12个复孔的平均值±标准差；*表示两组间有显著性差异在去除药物的可逆性实验中，除T410ng/ml各组及T42.5ng/ml+CsA1.0g/ml组为部分恢复外，其余组min-1值与对

16、照组相近(表2)，表明CsA和T4可逆性抑制MsC增殖。二、不同剂量CsA联合雷公藤单体T4对MsC分泌IL-6的影响我们采用MTT法测定各孔细胞存活情况，并以此A值为分母矫正培养上清IL-6浓度，如表3所示。结果显示，不同浓度CsA组间有显著性差别，其中CsA 1.0g/ml组CsA0.1g/ml组CsA 0.01g/ml组CsA 0g/ml组；不同浓度T4间也有显著性差异，T4 10ng/ml组T42.5ng/mlT4 0.625ng/ml组T40组，P0.05，表明CsA和T4均剂量依赖性抑制系膜细胞IL-6产生，而且在本实验条件下，CsA的作用较T4更强。两药联合具有协同作用，P0.0

17、5。小剂量CsA联合T4时，CsA 0.1g/ml+T4 0.625ng/ml组IL-6浓度与CsA 1.0g/ml组无显著差别，P0.05，表明小剂量CsA联合T4对系膜细胞分泌IL-6的抑制与较大剂量的CsA相当。 表2可逆性实验中各组细胞的3H-TdR掺入率(min-1值)T4(ng/ml)102.50.6250CsA1.01344±258*1774±9*2271±2022178±135(g/ml)0.11755±224*2199±2142377±2952274±2510.011391±130*23

18、30±4301978±3642435±56201352±177*1998±2552174±2562280±293注：每组数据为一次典型实验共6个复孔的平均值±标准差；*表示与对照组相比有显著性差别 表3药物作用下各组细胞培养上清中IL-6的含量(pg/ml)/MTT A值T4(ng/ml)102.50.6250CsA1.0110.3±9.86210.9±25.7281.7±34.7396.0±67.0*(g/ml)0.1168.0±29.4254.9±32

19、.6348.6±67.1*467.5±59.80.01270.1±43.2423.8±64.3580.9±34.4667.1±39.50567.4±47.5680.4±52.9720.7±54.5852.8±58.1注：每组数据为一次实验共6个测定值的平均值±标准差*表示两组间无统计学差别，P0.05三、CsA及T4对MsC IL-6 mRNA表达的影响五个样本IL-6、-actin PCR产物电泳结果，是用激光密度扫描仪定量测定每一条带的面积A值，计算相对单位列于表4。结果显示，所有

20、加药组IL-6相对单位均低于对照组，组间顺序为CsA 1.0g/ml+T4 10ng/mlCsA 1.0g/mlCsA 0.1g/ml+T4 0.625ng/mlT4 10ng/ml对照组。 表4药物作用下MsC IL-6及-actin RT-PCR产物电泳激光密度扫描结果(面积A值)lane1lane2lane3lane4lane5IL-60.19020.30880.38110.43050.4468-actin1.11081.25101.34101.22161.0222相对单位0.17120.24690.28420.35240.4372注：lane1:CsA1.0g/ml+T410ng/ml

21、lane2:CsA1.0g/mllane3:CsA0.1g/ml+T40.625ng/mllane4：T410ng/mllane5：未加CsA或T4Marker:PBR322-Hinf 讨论系膜细胞是体外研究肾炎发生机理及治疗常用的细胞模型。系膜细胞增殖及炎症介质的释放在肾炎的发生、发展及肾小球硬化中具有极其重要的作用，因此，抑制系膜细胞增殖及炎症介质的释放是治疗肾炎的关键环节之一。CsA和雷公藤治疗肾小球肾炎取得了良好疗效。近年来，细胞生物学和分子生物学的发展使人们对药物的作用机制有了进一步的认识。CsA除选择性抑制TH淋巴细胞IL-2mRNA表达之外，还剂量依赖性抑制系膜细胞增殖13。雷公

22、藤单体T4也主要抑制T淋巴细胞IL-2mRNA表达、受体反应性及系膜细胞增殖4，5，但与CsA不同的是它不需要受体，不伴有胞内钙浓度的变化。本研究中，我们在进一步了解单一CsA、T4对系膜细胞增殖、IL-6mRNA表达及蛋白合成影响的基础上，重点观察二药的联合作用，特别是小剂量CsA联合T4的作用。结果显示，单一CsA和T4均剂量依赖性抑制体外培养的人系膜细胞增殖，其中T410ng/ml的作用远远强于CsA1.0g/ml。CsA联合T4时，产生明显的协同作用。小剂量CsA(0.1g/ml)联合T40.625ng/ml时，其效应大于CsA1.0g/ml，这一结果与本实验最初的设想相符。去除药物的

23、可逆性实验表明CsA及T4的作用为功能性抑制而非毒性损害，这一点在其他作者的实验中也得到证实。1997年国内学者等对小鼠同种异体皮肤移植、肾移植的研究表明CsA与雷公藤内酯醇具有协同抗排异作用6，与本结果有类似之外。CsA及T4抑制系膜细胞增殖的机制目前尚不清楚。有作者认为CsA可能通过抑制蛋白激酶C及Na-K-ATP酶的活性，抑制细胞增殖7，8。CsA也可能通过某些细胞因子起作用。一些作者发现CsA能促进多种细胞表达TGF，而高浓度TGF抑制细胞增殖9，10。对T淋巴细胞的研究发现，CsA抑制一些促分裂淋巴因子的产生以及c-fos、c-myc原癌基因表达，从而抑制细胞增殖。关于T4作用的分子

24、机制，目前尚未见报道。在系膜细胞分泌的炎症介质中，IL-6与系膜增殖性肾炎的关系尤其引人注目11。我们测定了药物作用24小时培养上清IL-6浓度，结果显示CsA和T4均剂量依赖性抑制系膜细胞IL-6的产生，两药联合具有明显的协同效应，较小剂量CsA、T4联合可产生与大剂量CsA相当的抑制效应。CsA、T4究竟作用于IL-6蛋白合成的哪一环节，目前尚不清楚。以往对T淋巴细胞的研究显示CsA与胞内受体cyclophilin结合，再进一步结合并抑制calciurin/calmodulin酶活性，从而阻断转录核因子NFAT的激活与易位。NFAT为DNA结合蛋白，激活后可从胞浆易位至核内，结合于细胞因子

25、启动子区，诱导mRNA转录。CsA与受体结合，阻断了NFAT的激活，因而阻断了IL-2、IL-3、IL-4、IL-6等细胞因子mRNA转录12。我们采用RT-PCR法研究了五个有代表性加药组IL-6mRNA表达情况，结果发现所有加药组IL-6mRNA表达均低于对照组，各组细胞IL-6mRNA表达由弱强依次为CsA 1.0g/ml+T4 10ng/ml组CsA1.0g/ml组CsA 0.1g/ml+T4 0.625ng/ml组T4 10 ng/ml组对照组，这一顺序与IL-6蛋白水平的变化一致。因此可以认为，CsA及T4通过抑制系膜细胞IL-6mRNA表达而减少蛋白合成，这一作用可能是它们治疗肾

26、炎的又一机制。比较本实验条件下CsA及T4的作用，发现它们虽均可抑制系膜细胞增殖、IL-6mRNA表达及蛋白合成，但作用的重点却不相同。T4对系膜细胞增殖的抑制明显大于CsA，而CsA抑制IL-6的分泌却强于T4，提示二药的作用机制有所差别，这种差别，使二药合用更具优点。比较小剂量CsA(0.1g/ml)联合T4(0.625ng/ml)组与大剂量CsA组(1.0g/ml)的作用，发现前者对细胞增殖、IL-6合成的抑制均达到或超过后者，表明较小剂量的CsA、T4联合可获得相当于较大剂量CsA的免疫抑制强度。这一结果为临床制定合理的用药方案提供了新的思路，因较小剂量的CsA和T4联合可能具有较低的

27、毒副作用，关于这一方面尚需实验进一步证实。参考文献1Copeland KR,Yatscoftl RW.Comparison of the effects of cyclosporin and its metabolites on the release of prostacyclin and endothelin from mesangial cells.Transplantation,1992,53:640645.2Radeke HH,Christians U,Bleck JS,et al.Additive and synergistic effects of cyclosporine metabolited on glomerular mesangial cells.Kidney Int ,1991,39:12551266.3万象，范川义，黄东波.长期环孢霉素A对体外培养鼠肾丝球细胞之影响。中华医志(Taipei)，1992，49：3440.4董彦章，蒋明，朱立平，等.雷公藤多甙对人淋巴细胞IL-2自泌环路的抑制作用。中国医学科学院学报，1993，15：193195.5张丽华，毕增祺，李学旺，等.雷公藤T4单体对体外培养的系膜细胞增殖及IL-1产生的影响。中国医学科学院学报，1994，16：270275.6扬俊伟，樊忠民，