实验四+圆二色光谱_CD_+2014.11.3

1、一、预备知识一、预备知识平面偏振光平面偏振光:振动方向保持不变（只振动方向保持不变（只在一个平面上振动）在一个平面上振动）振幅发生周期性变化。振幅发生周期性变化。起偏器起偏器电场矢量电场矢量传播方向传播方向平面偏振光的产生平面偏振光的产生:自然光通过起偏器（偏自然光通过起偏器（偏振片或振片或Nicol棱镜）。棱镜）。一、预备知识一、预备知识圆偏振光圆偏振光: : 振幅保持不变，而方向周期性变化，电场矢振幅保持不变，而方向周期性变化，电场矢量绕传播方向螺旋前进。量绕传播方向螺旋前进。左右旋圆偏振光：左右旋圆偏振光：一束平面偏振光可以分解成两一束平面偏振光可以分解成两数振幅相同，频率相同，旋转数振

2、幅相同，频率相同，旋转方向相反的左、右旋圆偏振光。方向相反的左、右旋圆偏振光。右旋是顺时针方向；左旋为逆右旋是顺时针方向；左旋为逆时针方向。时针方向。旋转方向相反的旋转方向相反的左、右圆偏振光左、右圆偏振光透过一光学透过一光学活性物质后活性物质后透过的左、右圆偏振光透过的左、右圆偏振光振幅振幅相位相位矢量和矢量和相等相等相同相同平面偏振光平面偏振光相等相等不同不同平面偏振光，方向改变平面偏振光，方向改变不等不等相同相同椭圆偏振光椭圆偏振光不等不等不同不同椭圆偏振光，方向改变椭圆偏振光，方向改变光的叠加：光的叠加：一束一束自然光自然光可以看作是两束相互垂直而没有相位关系的可以看作是两束相互垂直而

3、没有相位关系的平面偏平面偏振光振光的加和。的加和。一、预备知识一、预备知识圆二色性：圆二色性：如果旋光物质对特定波长的入射光有吸收，而且如果旋光物质对特定波长的入射光有吸收，而且对左旋和右旋圆偏振光的吸收能力不同，那么在对左旋和右旋圆偏振光的吸收能力不同，那么在这种情况下，不仅左旋和右旋圆偏振光的传播速这种情况下，不仅左旋和右旋圆偏振光的传播速度不同，而且振幅也不同，于是，随着时间的推度不同，而且振幅也不同，于是，随着时间的推移，左右旋圆偏振光的合成光振动矢量的末端，移，左右旋圆偏振光的合成光振动矢量的末端，将循着一个椭圆的轨迹移动。这就是说，由速度将循着一个椭圆的轨迹移动。这就是说，由速度不

4、同振幅也不同的作右旋圆偏振光叠加所产生的不同振幅也不同的作右旋圆偏振光叠加所产生的不再是线偏振光，而是椭圆偏振光，这种现象称不再是线偏振光，而是椭圆偏振光，这种现象称为圆二色性。为圆二色性。二、基本原理二、基本原理二、基本原理二、基本原理圆二色性可用吸收率差和椭圆度来表示：圆二色性可用吸收率差和椭圆度来表示： 吸收吸收(率率)差差 ： = L - R ；A = AL AR 由于由于 绝对值很小，常用摩尔椭圆度绝对值很小，常用摩尔椭圆度 来来代替，二者的关系是：代替，二者的关系是：椭圆度椭圆度，摩尔椭圆度，摩尔椭圆度 =2.303(AL AR)/4 = 3298(L - R)3300 (L -

5、R) 入射光透射光旋光度椭圆度A：介质对圆偏振光的吸收介质对圆偏振光的吸收：介质对圆偏振光的摩尔消光系数，介质对圆偏振光的摩尔消光系数， 单位：单位： cm2/dmol二、基本原理二、基本原理v 当光学活性化合物对光没有特征当光学活性化合物对光没有特征吸收时，在谱图中仅为一条近似吸收时，在谱图中仅为一条近似水平的直线。水平的直线。v 当光学活性化合物对光存在特征当光学活性化合物对光存在特征吸收时，通常有两种情况：吸收时，通常有两种情况： 当当 L R 时，得到一个正性时，得到一个正性的圆二色光谱曲线；的圆二色光谱曲线； 当当 L R 时，得到一个负性的时，得到一个负性的圆二色光谱曲线。圆二色光

6、谱曲线。光学活性物质：光学活性物质：物质旋转偏振光振动平面的能力称为光物质旋转偏振光振动平面的能力称为光学活性，而该物质被称为光学活性物质。学活性，而该物质被称为光学活性物质。 凡手性分子或者凡手性分子或者对映异构体的分子才对映异构体的分子才具有光学活性，即可具有光学活性，即可使偏振光的振动面发生旋转。使偏振光的振动面发生旋转。三、三、CDCD光谱的应用光谱的应用意义：意义：CD是一种特殊的吸收谱，它对手性分子的构象十是一种特殊的吸收谱，它对手性分子的构象十分敏感；分敏感；许多有机物和络合物都具有手性，它们的对映异构许多有机物和络合物都具有手性，它们的对映异构体物理化学性质体物理化学性质(熔点

7、、沸点、旋光度、溶解度、分熔点、沸点、旋光度、溶解度、分子式等子式等)几乎完全相同，但它们的旋光方向相反，生几乎完全相同，但它们的旋光方向相反，生理作用大不相同；理作用大不相同；对于金属络合物在波长大于对于金属络合物在波长大于 300nm 的区域，包括的区域，包括可见区域，对可见区域，对 CD 的贡献来自含有金属离子的生色的贡献来自含有金属离子的生色团，这一波段的团，这一波段的 CD 谱对金属离子的氧化态、配位谱对金属离子的氧化态、配位态及链链相互作用均是敏感的。态及链链相互作用均是敏感的。 生物基础分子一般都具有手性，也都具有光学活生物基础分子一般都具有手性，也都具有光学活性。在对生物分子手

8、性的研究中，发现了令人惊性。在对生物分子手性的研究中，发现了令人惊异至今不解的异至今不解的对称性破缺现象对称性破缺现象，那就是在自然界，那就是在自然界中，氨基酸有中，氨基酸有L L型和型和D D型两种对映异构体，天然糖型两种对映异构体，天然糖也有也有L L糖和糖和D D糖两种糖。但在生物体中，组成蛋白糖两种糖。但在生物体中，组成蛋白质的质的2020种氨基酸，除最简单的甘氨酸不具有手性种氨基酸，除最简单的甘氨酸不具有手性外，其余都是外，其余都是L L型的，而生物体核酸中的糖环则都型的，而生物体核酸中的糖环则都是是D D型的。生物体中这种对称性破缺现象是有特殊型的。生物体中这种对称性破缺现象是有特

9、殊意义的自然现象。意义的自然现象。 三、三、CDCD光谱的应用光谱的应用 CDCD已成为研究分子构型和分子间相互作用的最重已成为研究分子构型和分子间相互作用的最重要的光谱实验之一；要的光谱实验之一；蛋白质的圆二色性蛋白质的圆二色性 (1)(1)由氨基酸通过肽键连接而成；由氨基酸通过肽键连接而成； (2)(2)光学活性基团：肽键（光学活性基团：肽键（250nm250nm以下的光谱以下的光谱区）、芳香氨基酸残基、二硫桥键（区）、芳香氨基酸残基、二硫桥键（250250300nm300nm光光谱区）；谱区）； (3)(3)蛋白质有多个结构层次，相同的氨基酸序蛋白质有多个结构层次，相同的氨基酸序列，因蛋

10、白质的折叠结构不同，基团的光学活性列，因蛋白质的折叠结构不同，基团的光学活性受到影响。受到影响。三、三、CDCD光谱的应用光谱的应用v苯丙氨酸（苯丙氨酸（ phenylalanine， Phe）：255、261和和268nm附近；附近；v酪氨酸（酪氨酸（ tyrosine， Tyr） ：277nm左右；左右；v色氨酸（色氨酸（ tryptophan， Trp） ： 279、284和和291nm附近；附近；v二硫键的变化反映在整个近紫外区。二硫键的变化反映在整个近紫外区。 芳香氨基酸残基及二硫键芳香氨基酸残基及二硫键处于不对称微环境时，处于不对称微环境时，在在近紫外区近紫外区表现出表现出CD信号

11、信号例例1、100% -螺旋螺旋2、100% -折叠折叠3、100%无规卷曲无规卷曲多聚L-赖氨酸在不同构象条件下的标准CD光谱蛋白质蛋白质CDCD光谱分析光谱分析二级结构二级结构定性分析定性分析例例 chymotrypsin (all b) lysozyme (a + b) triosephosphate isomerase(a/b) myoglobin (all a)蛋白质CD光谱分析三级结构定性分析例例蛋白质蛋白质CDCD光谱分析光谱分析定量分析定量分析假设蛋白质在波长假设蛋白质在波长处的处的CDCD信号是蛋白质中各种二级信号是蛋白质中各种二级结构组分的线性加和，则有等式：结构组分的线性

12、加和，则有等式：iiCfC 假设溶液态蛋白质与晶体中的二级结构相同，则可利用已知二级结构假设溶液态蛋白质与晶体中的二级结构相同，则可利用已知二级结构的蛋白质或多肽的的蛋白质或多肽的CDCD光谱作为参考数据，对未知蛋白质的二级结构进行光谱作为参考数据，对未知蛋白质的二级结构进行拟合计算，能得出拟合计算，能得出-螺旋、螺旋、-折叠、折叠、-转角、无规线团等结构所占转角、无规线团等结构所占的比例。的比例。 用于拟合的参考蛋白质共有用于拟合的参考蛋白质共有4848种，包括有种，包括有JohnsonJohnson等报道的等报道的2929种，种， KeiderlingKeiderling等报道的等报道的5

13、 5种，种， YangYang等报道的等报道的6 6种及种及SreeramaSreerama等最近报道的等最近报道的3 3种球蛋白和种球蛋白和5 5种失活蛋白质。种失活蛋白质。核酸的CD光谱分析双链和四链定性分析例例duplexG-quadruplex四、圆二色光谱仪的基本构造四、圆二色光谱仪的基本构造五、实验要点五、实验要点样品浓度：样品浓度：最好预先做最好预先做UV-VISUV-VIS光谱，检查吸收波段范围；光谱，检查吸收波段范围；CDCD光谱与紫外光谱有同样的要求，最佳信噪比光谱与紫外光谱有同样的要求，最佳信噪比范围是紫外吸收为范围是紫外吸收为0.6-1.20.6-1.2，通常吸收值超过

14、，通常吸收值超过2 2时，很难得到合适的时，很难得到合适的CDCD数据数据。样品池样品池样品池：高度均匀的熔融石英，不会带来附加的圆样品池：高度均匀的熔融石英，不会带来附加的圆二色性。二色性。光程：光程：0.010.01cm-1cmcm-1cm，为了降低溶剂影响，一般提高为了降低溶剂影响，一般提高样品浓度，用短光程。样品浓度，用短光程。五、实验要点五、实验要点吹氮处理：吹氮处理：必须使用干燥氮气在一直吹光源：必须使用干燥氮气在一直吹光源：Xe lamp 有石英包层，如果在空气中操作，将产生很多臭有石英包层，如果在空气中操作，将产生很多臭氧，损坏反射镜；氧，损坏反射镜；195nm以下氧气吸收辐射光。以下氧气吸收辐射光。带宽：带宽：标准标准1 nm，远紫外区，远紫外区2 nm高分辨率测量用较窄的狭缝宽度，此时高分辨率测量用较窄的狭缝宽度，此时PMT电压较高，信电压较高，信噪比差；噪比差；累积扫描：累积扫描：可以扫描多次提高信噪比。可以扫描多次提高信噪比。五、实验要点五、实验要点HT plotHT plot 通