缝隙连接蛋白43在缺血预处理心肌保护中的作用

1、缝隙连接蛋白43在缺血预处理心肌保护中的作用         11-03-15 09:57:00     编辑：studa20           作者：刘超，王云，顾继伟，袁亚伟，冯东，高致炳 【摘要】  目的 探讨缝隙连接蛋白43（Connexin 43,Cx43）在缺血预处理心肌保护中的作用和地位。方法 将48只SD大鼠分为假手术组（S组）、缺血再灌注

2、组（IR组）、缺血预处理组（IP组）和5-羟基癸酸+缺血预处理组（5-HD + IP组），测定各组的心律失常评分和心肌梗死面积，采用逆转录-聚合酶链反应技术（RT-PCR）检测各组心肌Cx43的表达水平。结果 IR组和5-HD+IP组的心律失常发生多于IP组，评分明显高于IP组（P0.01）；IR组和5-HD+IP组的IS/AAR比值明显大于IP组（P0.01）；与IR组和5-HD+IP组比较，IP组Cx43 mRNA的表达明显增强（P0.01）。IP可以减少心律失常发生，减小心肌梗死面积，增强Cx43的表达，5-羟基癸酸可以阻断IP的心肌保护作用。结论 IP通过开放线粒体ATP敏感性钾通道保

3、持Cx43磷酸化，进而实现心肌保护。 【关键词】  缝隙连接蛋白43；缺血再灌注损伤；缺血预处理；心肌保护Abstract: Objective  To investigate the effect and status of connexin 43 on myocardial protection in ischemic preconditioning.Methods  48 Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: S,IR,IP,5-HD+IP.The myocardial inf

4、arct size and arrhythmia score were measured.The expression of connexin 43 was detected by RT-PCR.Results  Compared with group IP,arrhythmia score and IS/AAR was higher and the expression of connexin 43 was notablely lower in group IR and group 5-HD+IP (P0.01).Ischemic preconditioning might red

5、uced arrhythmogenesis and myocardial infarct size,meanwhile enhanced the expression of connexin 43.5-hydroxydecanoate acid might interdicted the myocardial protection of IP (P0.01).Conclusion  Ischemic preconditioning might play an important role in myocardial protection by activating mitochond

6、rial ATP sensitive potassium channel and preserving connexin 43 posphorylation.Key words:connexin 43；ischemia-reperfusion injury；ischemic preconditioning；myocardial protection如何减轻再灌注损伤、保护缺血心肌，一直是心血管病学领域研究的重要内容，缺血预处理（Ischemic preconditioning，IP）被认为是一种最有效的心肌保护方法，缺血预处理能使心室细胞间最主要的缝隙连接蛋白43（Cx43）表达量增加，分布模

7、式改变以实现心肌保护，Cx43在心肌IP中的作用越来越受到重视，本研究旨在探讨Cx43在缺血预处理心肌保护中的作用和地位。1  材料与方法1.1  对象和材料 健康雄性SD大鼠48只（宁夏医科大学实验动物中心提供），体重250300g。伊文氏蓝（Evens Blue,AMERSCO公司），氯化三苯基四氮唑（TTC,AMERSCO公司），5-羟基癸酸（5-hydroxydecanoate acid,5-HD,Sigma公司），SABC免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程公司），Accesss RT-PCR系统A1250（Promega公司），TR

8、Izol Reagent（Invitrogen公司）。1.2  方法1.2.1  模型构建及实验分组 大鼠随机分为4组，每组12只。称重后腹腔注射3%戊巴比妥钠60mg·kg-1。麻醉后固定于实验台，气管插管连接ALC-V8型动物呼吸机，呼吸频率70次·min-1，潮气量67mL·次-1。持续记录心电图，信号输入BL-420F生物机能实验系统保存。在胸骨左缘第3、4肋间开胸，于左心耳下缘与肺动脉圆锥间前降支处留置结扎线。（1）假手术组（S组）：建立动物模型后仅穿线而不结扎；（2）缺血再灌注组（IR组）：结扎左冠状动脉前降支30 min

9、，再灌注120 min；（3）缺血预处理组（IP组）：结扎左冠状动脉前降支5 min，再灌注5 min，重复3次后同IR组；（4）5-羟基癸酸和缺血预处理组（5-HD +IP组）：于IP前15 min按5mg·kg-1 iv.后同IP组。1.2.2  心律失常的测定 记录各组室性期前收缩次数（VE）、室性心动过速时间（VTt）、心室颤动时间（VFt）和其他心律失常的发生情况，用心律失常评分量化心律失常的严重程度，根据Lambeth规则进行心律失常分析，参考Wang等1的评分标准：（1）0分：无室性心律失常；（2）1分：偶发室性期前收缩（l min内发生3次以下的V

10、E）；（3）2分：频发室性期前收缩（l min内发生3次或3次以上的VE）；（4）3分：偶发性室性心动过速（l min内发生3次以下的VT）；（5）4分：频发性室性心动过速（l min内发生3次或3次以上的VT）或偶发性室颤（l min内发生3次以下的VF）；（6）5分：频发性室颤（l min内发生3次或3次以上的VF）或死亡。1.2.3  心肌梗死面积的计算每组随机选取6只大鼠，用Evens Blue-TTC法测定心肌梗死面积。心肌缺血再灌注末再次结扎前降支，5% Evens Blue 1mL注入左心耳，以区分心肌的梗死区（不染色）和非心梗区，取出心脏后切成56片约2mm厚的心肌片

11、，置2mL 1% TTC磷酸缓冲溶液中（pH 7.4），在37温孵20 min染色后，置10%的甲醛中固定，缺血危险区（AAR）为红色，梗死区（IS）为白色。每张心肌切片数码照相，采用Image-Pro Plus 5.0 图象分析软件（Media Cybernetics 公司，美国）以求积法测定缺血区和梗死区面积，心肌梗死的严重程度以IS/AAR表示，IS/AAR=（梗死面积×切片重量）/（缺血面积×切片重量）×100%。1.2.4  RT-PCR 取余24只大鼠左室心肌组织50100mg，采用TRIzol 试剂提取样本总RNA，再用Acces

12、ss RT-PCR系统A1250合成Cx43和-actin的cDNA。引物序列：Cx43上游引物：5-TGT AAC ACT CAA CAA CCT GGC-3，下游引物：5-GGT TTT CTC CGT GGG ACG TGA-3，产物462bp；-actin上游引物：5-TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG-3，下游引物：5-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG-3，产物764bp。扩增条件：4845min，94 2min；变性94 30s，退火53 1min，延伸68 2min，共40个循环；最终延伸68 7min。取PCR产物进行琼

13、脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察并拍摄电泳图像，Quantity one v4.6.2（BIO-RAD）图像分析软件进行荧光半定量分析，测定平均光密度值（OD），用Cx43与-actin的Density值表示Cx43 mRNA的表达水平。1.3  统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行分析，数据均以均数±标准差(±s)表示，结果分析采用t检验和单因素方差分析。2  结果2.1  心律失常情况除S组偶见VE，其他三组再灌注30 min内多表现出VE和VT，IR组和5-HD+IP组的心律失常发生多于IP组，评分明显高于IP组，差异均有统计学意义（P0.01，见表1）。表1  各组大鼠心律失常发生情况(略)2.2  心肌梗死面积测定S组未见心肌梗死区，IR组和5-HD+IP组的IS/AAR比值明显大于IP