葛根素对肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护作用及其保护机制的研究(1)

1、葛根素对肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注损伤保护作用及其保护机制的研究(1)】 目的 观察葛根素（Pue）对肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注损伤是否具有保护作用，及其保护机制。方法 首先建立大鼠肝硬化动物模型，在此模型基础上建立大鼠全肝缺血再灌注模型，比较用Pue预处理对缺血再灌注后，肝组织光镜下的形态学改变；血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和氧化亚氮（NO）、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性，及肝组织中NO、肿瘤坏死因子（TNF-）、MDA含量、SOD活性变化。结果 Pue预处理可使大鼠血清NO含量、肝组织NO含量及SOD活性明显增高；而血清ALT、AST、M

2、DA含量及肝组织TNF-、MDA含量明显降低；肝组织形态损伤也有所减轻。结论 葛根素对肝硬化大鼠肝缺血再灌注损伤有显著的保护作用，其主机制是减少NO的降低、扩张血管、改善微循环；清除氧自由基、减轻脂质过氧化。【关键词】 葛根素；药物预处理；缺血再灌注损伤；肝硬化；大鼠现代肝胆外科中避免术中过多的出血，及时而有效地控制出血是手术成功的关键之一，阻断肝血流技术在肝切除术中被广泛应用。许多肝脏疾病患者往往伴有肝硬化，其硬化肝脏对缺血的耐受性较差，长时间阻断入肝血流或术中大出血均可引起I/R损伤而加重处于代偿边缘的肝脏负担，导致术后发生肝功能衰竭的可能性增大。因此寻找一种对肝硬化肝脏缺血及再灌注具有保

3、护作用的药物及方法具有重临床意义。以往采用的缺血预处理的方法有其缺陷并在临床应用中受到限制，故寻找一种药物预处理来保护肝组织、减轻I/R损伤具有重的临床价值。以往试验证明葛根素对正常肝脏及其他多个组织器官的I/R损伤具有良好的保护作用。本次试验通过葛根素预处理及缺血预处理对肝硬化大鼠肝脏I/R损伤保护作用的对比，探讨葛根素是否对肝硬化大鼠肝脏的I/R损伤具有保护作用，并进一步研究其作用机制。1 材料与方法1.1 动物 Wastar大鼠200只，体重200220g，雌雄各半。1.2 仪器与试剂 奥林巴斯2700全自动生化分析仪、DY89-1全自动玻璃匀浆机、Arthos HT酶标仪、SANYO

4、MDF-330型-70低温冰箱、HH21-600型恒温水浴箱、722分光光度计。CCl4，泸州市鑫达化工有限公司提供，批号20050713；食用酒，泸州市食品厂提供；葛根素注射液哈尔滨三联药业有限公司提供，批号050102B；SOD测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供，黄嘌呤氧化酶法测定，批号20050716；MDA测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供；TBA法测定，批号20050716；NO测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供，亚硝酸盐法测定，批号20050719；TNF-测定试剂盒，上海森雄科技实业有限公司，双抗体夹心ABC-ELISA法测定，批号20050719。1.3 模型制备及

5、试验方法1.3.1 大鼠肝硬化模型制备 经大鼠腹部皮下注射CCl4大豆油溶液，前4次剂量为0.5ml/100g体重60% CCl4大豆油溶液，每隔3天1次，第4次后间隔7天注射第5次（可减少大鼠死亡率），第5次起剂量改为0.3ml/100g体重40% CCl4大豆油溶液，每隔3天1次，共13次；除注射CCl4当日外，每日1次60%食用酒灌胃，乙醇剂量0.4g/100g体重；给予正常饮水；以高脂低蛋白饲料喂养。上述操作第6周末停止，继续观察至8周末大鼠肝硬化模型制备成功并趋于稳定。第2周起每周末行B超定位肝穿刺病理检查，8周末挑选肝硬化程度趋于同一水平大鼠128只，继续进行下面试验。1.3.2

6、动物分组 按随机数字表法，将128只大鼠随机分为4组，每组再分为4个时间亚组，每亚组8只大鼠。4组分别为A组：假手术组；B组：单纯缺血再灌注组；C组：缺血预处理组；D组：葛根素预处理组。4个时间亚组分别为a亚组：缺血前时间亚组；b亚组：缺血再灌注后1h时间亚组；c亚组：缺血再灌注2h时间亚组；d亚组：缺血再灌注6h时间亚组。1.3.3 缺血再灌注模型的制备 术前禁食12h，自由饮水。以戊巴比妥钠3mg/100g体重腹腔注射麻醉后开腹并充分显露肝门，游离门静脉及肝固有动脉，用无损伤动脉钳给予钳夹，30min后移去动脉钳复灌60min，形成全肝I/R模型。C组于缺血前反复3次缺血5min再灌注5m

7、in形成缺血预处理模型及术前D组12h、1h分别2次分别给予Pue 10mg/100g体重，其他各组给予等量生理盐水，再行缺血30min，再灌注60min，D组形成葛根素预处理模型。1.3.4 标本采集 B、C、D组动物在再灌注0h（即缺血前）、再灌注1h、2h、6h后分别从各时间亚组大鼠心内取血5.0ml，不加抗凝剂静置2h，并标明分组及动物编号，用自动平衡离心机离心，取部分血清测定ALT、AST的含量，其余的置入-70冰箱内待测定NO、SOD、MDA。取血后快速取右肝组织进行HE染色光镜观察；其他肝组织取0.5g制备10%组织匀浆，检测其中NO、SOD、MDA及TNF-。A组亦在相对应的时

8、间点取血及肝组织行上述检查。在实验完毕时处死动物。2 结果2.1 病理结果 各组低倍镜下均可见肝小叶结构紊乱，肝小叶重建，可见纤维再分隔现象，肝内假小叶广泛形成，同时伴有明显的肝细胞结节状再生等肝硬化病理表现。A组：除上述表现外未见其他异常。B组：高倍镜下可见肝细胞核边聚、浓缩及溶解，胞浆疏松化，并可见嗜酸性浸润；肝窦明显狭窄，可见大量的红细胞淤积其内并有微血栓形成、中性粒细胞贴壁等。C组：高倍镜下可见肝细胞核边聚、浓缩及溶解，胞浆疏松化，但较B组显著减轻；肝窦狭窄较轻，但仍有红细胞淤积及微血栓形成现象，炎性细胞浸润减少。D组：高倍镜下仅偶见核边聚，胞浆疏松化；肝窦无明显狭窄，内无明显红细胞淤

9、积，及其微血栓形成等，汇管区炎性细胞浸润不明显。2.2 血清及肝脏组织匀浆检验结果2.2.1 各组大鼠肝功酶学指标变化 D组肝功酶学检验缺血前与其他各组无明显差异（P0.05），再灌注后各时间点明显降低B组（P0.05），与C组无显著差异（P0.05），C、D组再灌注6h时较B组ALT、AST显著降低（P0.05），但与A组相比未完全恢复正常（孙 鹏，李五生，张 楠，周小娜，刘金龙【摘】目的观察葛根素（Pue）对肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注损伤是否具有保护 本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果

10、自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。P0.05），见表1。表1 4组大鼠灌注后各时间点血清ALT、AST的变化 （xs，u/L）注：与A组同时间点相比，P0.05；与同组灌注缺血前即0h时相比，P0.05；与B组同时间点相比，*P0.052.2.2 各组大鼠血清NO含量变化 C、D组血清NO与再灌注1h、2h含量较缺血前有所降低，但较B组下降幅度小（P0.05）。再灌注6h时C、D组恢复正常与A组差异无显著性（P0.05）；而B组含量明显升高，且高于A组（P0.05），见表2。表2 4组大鼠灌注后各时间点血清NO的变化 （xs，mol/L）注：与A组同时间点相比，P0.05，与同组灌注

11、缺血前即0h时相比，P0.05，与B组同时间点相比，*P0.052.2.3 各组大鼠血清SOD活性及MDA的含量变化 D组SOD活性与C组各时间点无明显差异（P0.05），明显高于B组（P0.01），再灌注1h时较A组降低（P0.05），灌注后6h时与假手术组差异无显著性（P0.05）。血清MDA含量，缺血再灌注1h、2h时C、D组较A组有所增高，但增高程度明显低于B组（P0.05），再灌注6h时，D组与A组比较差异无显著性（P0.05）。各组大鼠各时间点的血清SOD、MDA含量变化见表3。表3 4组大鼠灌注后各时间点血清SOD、MDA的变化 （xs）注：与A组同时间点相比，P0.05；与同组

12、灌注缺血前即0h时相比，P0.05；与B组同时间点相比，*P0.052.2.4 各组大鼠缺血再灌注后1h时肝脏中NO、MDA、TNF-含量及SOD活性差异 肝脏组织总的NO、MDA、TNF-含量及SOD活性与同时间点的血清中的各指标的趋势一致，即C、D组的NO含量及SOD活性显著高于B组（P0.05），但较A组稍低（P0.05），MDA及TNF-含量C、D组显著低于B组（P0.05），但较A组稍高（P0.05），见表4。表4 4组大鼠灌注后1h肝脏组织匀浆内NO、MDA、TNF-含量及SOD活性差异注：与A组同时间点相比，P0.05；与B组同时间点相比，*P0.053 讨论3.1 寻找对肝硬化

13、肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用药物的理由 现代肝胆外科中避免术中过多的出血、及时而有效地控制出血是手术成功的关键之一，阻断肝血流技术在肝脏切除术中被广泛应用1。严重肝脏疾病（如肝癌等）患者往往伴有肝硬化，其肝脏对缺血的耐受性较差2，长时间阻断入肝血流或术中大出血均可引起I/R损伤而加重处于代偿边缘的肝脏负担，导致术后发生肝功能衰竭的可能性增大。因此寻找一种对肝硬化肝脏缺血及再灌注具有保护作用的药物及方法具有重临床意义。以往采用的缺血预处理的方法有其缺陷并在临床应用中受到限制，故寻找一种药物预处理来保护肝组织、减轻I/R损伤具有重的临床价值。3.2 葛根素对肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注的保护作用及机

14、制 Pue进入体内后主分布于血浆、肾、肝和心。已有研究证实其在心、脑、肾等组织的I/R损伤中保护作用，近年来研究发现它具有改善微循环、抗氧化、调节血管内皮功能、抑制血小板聚集、降低血液黏度和抗肿瘤等多种作用，虽然以往报道长期（78天）应用葛根素可致少数患者转氨酶升高，但未见短期应用出现肝损害的报道，且已有相关报道3证实葛根素对正常肝脏的缺血再灌注损伤具有良好的保护作用。本实验结果显示：光镜下，与对照组相比Pue预处理组，肝细胞水肿及肝窦狭窄明显减轻，内无红细胞淤积及微血栓形成等，汇管区炎性细胞浸润不明显。血液中ALT、AST及肝组织中TNF-等反映肝损害的指标较对照组显著减少，表明Pue对肝硬

15、化大鼠肝脏有明确的保护作用。本次实验所证明主保护机制可能是：（1）调节NO的含量、改善微循环：NO是由血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、神经细胞等合成并释放的，由酶P450家族的NO合酶（NOS）产生，NOS作用于L-精氨酸和氧，产生L-谷氨酸和NO。人们已经发现3种NOS的亚型，即神经元型NOS（nNOS）、内皮型NOS（eNOS）、诱导型NOS（iNOS）4。这3种亚型在肝脏中都有表达5，nNOS和eNOS在肝脏中不同细胞选择性的表达，前者只在神经组织中可检测到，后者只在肝脏血管的内皮细胞中表达，当受到一定的刺激，iNOS在肝脏组织中广泛表达，尤以库普弗细胞和中性粒细胞中有大量iNOS表达。N

16、O量的多少是其加重或是减轻缺血再灌注损伤的重因素，eNOS亚型产生的低水平的NO能够抵抗移植物成活后再灌注产生的微循环损伤；而由于iNOS的转录诱导需时间较长，几小时后才大量的iNOS生成，较多的NO在生成，最终导致脂质过氧脂物产生、细胞死亡和肝脏损伤。Pue可在缺血再灌注早期维持肝组织及血清内NO含量使之不会过多降低，改善缺血再灌注后肝组织微循环，减轻再灌注后的无复流现象的发生，对肝脏组织进行保护。（2）抗脂质过氧化作用：SOD是一种广泛存在于生物体内的抗氧化酶，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重的作用，可清除氧自由基及保护细胞免受氧自由基损伤的作用6。缺血再灌注损伤时产生大量的氧自由基，氧

17、化生物膜的不饱和脂肪酸，使生物膜发生脂质过氧化反应，导致细胞结构和功能障碍，造成缺血再灌注损伤。同时形成大量分解产物MDA。MDA含量多少在一定程度上反映了氧自由基对组织、细胞损伤的程度。本试验通过对SOD与MDA的联合检测表明：应用葛根素组缺血再灌注后SOD活性较对照组显著升高（P0.05），而MDA含量明显低于对照组（P0.05），提示葛根素可通过增加SOD活性，清除过多的氧自由基，抑制脂质过氧化反应等作用来达到保护缺血再灌注肝脏的目的。总之，缺血再灌注损伤是由多种因素引起的，并非单一因素所致。本实验证实，Pue可通过调节NO含量、改善微循环、清除自由基等途径对肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注损伤

18、产生较好的保护作用。实验中D组短期使用Pue，缺血前转氨酶较其他组差异无显著性（孙 鹏，李五生，张 楠，周小娜，刘金龙【摘】目的观察葛根素（Pue）对肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注损伤是否具有保护 本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。P0.05），且全过程中无一只大鼠出现出血倾向，可证明短期应用Pue不会增加肝脏功能的损害及凝血机制障碍的发生率，所以笔者认为Pue是对肝硬化肝脏缺血再灌注保护有研究前景的药物之一。【参考文献】1 梁力建，赖家明，黄洁夫.正确掌握肝血流阻断的时机与时限.肝胆外科杂志，1998，6（s）：261-262.2 黄志强.现代腹部外科学.长沙：湖南科学技术出版社，1997，274-276. 3 金建军，张中乐.葛根素对肝缺血再灌注损伤的