生物化学实验-酵母RNA的分离组分鉴定及含量分析课件

1、生物化学实验-酵母RNA的分离组分鉴定及含量分析生物化学实验-酵母RNA的分离组分鉴定及含量分析1 1、掌握稀碱法分离酵母、掌握稀碱法分离酵母RNARNA的原理与操作过程。的原理与操作过程。2 2、了解、了解RNARNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。的组分并掌握定性鉴定的具体方法。3 3、学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理、学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。和操作方法。 实验目的实验目的 生物化学实验-酵母RNA的分离组分鉴定及含量分析 本实验用本实验用0.2% NaOH 0.2% NaOH 使酵母裂解，然后用酸中和，除去蛋使酵母裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液

2、用乙醇沉淀白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA RNA 。1. 1. 核酸分离核酸分离 原理原理 生物化学实验-酵母RNA的分离组分鉴定及含量分析酶促水解酶促水解化学水解化学水解: : 酸水解酸水解: :碱基、核糖碱基、核糖/ /脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸 碱水解碱水解: :RNARNA存在存在2-OH2-OH，磷酸二酯键不稳定，得单核苷酸，磷酸二酯键不稳定，得单核苷酸2. 2. 组分鉴定组分鉴定RNA是由核糖、嘌呤/嘧啶碱和磷酸组成，提取得的 RNA 中加10% 硫酸煮沸即可得到这些组分的混合溶液 （$），分别进行定性鉴定，以证明提取物是否为核酸。 原理原理 生物化学实验-酵母RNA的分

3、离组分鉴定及含量分析 $ $生物化学实验-酵母RNA的分离组分鉴定及含量分析CHOCHOHCH2OH()3thick HClOCHOCH3HOOHF3+Green substance $ $ $ $生物化学实验-酵母RNA的分离组分鉴定及含量分析3. RNA含量测定含量测定核酸（核酸（DNADNA和和RNARNA）碱基的苯环结构在紫外区有较强吸收，）碱基的苯环结构在紫外区有较强吸收，吸收高峰在吸收高峰在260nm260nm波长处，蛋白质则在波长处，蛋白质则在280nm280nm波长处。波长处。当当ODOD2602601 1时，时，dsDNAdsDNA浓度约为浓度约为50g / ml50g /

4、ml ssDNA ssDNA浓度约为浓度约为37g / ml37g / ml RNA RNA浓度约为浓度约为40g / ml40g / ml纯纯DNADNA：ODOD260260/OD/OD2802801.81.8 ( (1.9,1.9,表明有表明有RNARNA污染；污染；1.61.6，表明有蛋白质、酚等污染），表明有蛋白质、酚等污染）纯纯RNARNA：1.7 1.7 ODOD260260/OD/OD2802802.02.0 （1.71.7时表明有蛋白质或酚污染时表明有蛋白质或酚污染, ,可以增加酚可以增加酚 / /氯仿抽提）氯仿抽提）生物化学实验-酵母RNA的分离组分鉴定及含量分析ODOD2

5、60260/OD/OD280280的比值用于估计核酸的纯度的比值用于估计核酸的纯度,OD,OD260260/OD/OD230230估计去盐的估计去盐的程度。程度。 对于对于RNARNA纯制品，其纯制品，其ODOD260260/OD/OD2802802.02.0，ODOD260260/OD/OD230230应大于应大于2 2。 OD OD260260/OD/OD23023022说明去盐不充分说明去盐不充分, , 可以再次沉淀和可以再次沉淀和70%70%乙醇洗涤。乙醇洗涤。浓度计算：浓度计算：DNADNA样品的浓度（样品的浓度（g / lg / l）:OD:OD260260稀释倍数稀释倍数50/1

6、00050/1000RNARNA样品的浓度（样品的浓度（g / lg / l）：）：ODOD260260稀释倍数稀释倍数40/100040/1000生物化学实验-酵母RNA的分离组分鉴定及含量分析1 1提取提取称取干酵母粉称取干酵母粉0.4g0.4g，放入试管中，加入，放入试管中，加入0.2% NaOH 3mL0.2% NaOH 3mL，然后放入沸，然后放入沸水浴中提取水浴中提取15min15min。2 2分离分离用自来水冷却用自来水冷却, ,滴加滴加1-41-4滴醋酸，调滴醋酸，调pHpH至至6.06.0（沉淀蛋白质），（沉淀蛋白质），装入离装入离心管配平，心管配平，3000r/min300

7、0r/min离心离心3min3min，（使提取液与菌体残渣分离）（使提取液与菌体残渣分离）。3 3抽提抽提 收集上清液，加等体积的氯仿，震荡混匀，收集上清液，加等体积的氯仿，震荡混匀，3500r/min3500r/min离心离心5min5min。4 4沉淀沉淀RNARNA收集上清，平均分装入两支离心管中，各加收集上清，平均分装入两支离心管中，各加2 2倍体积无水乙醇，边加倍体积无水乙醇，边加边搅拌，配平，边搅拌，配平，3500r/min3500r/min离心离心5min5min，得到，得到RNARNA沉淀。沉淀。弃去上清液（弃净），一支离心管加弃去上清液（弃净），一支离心管加5mL5mL蒸馏水

8、回溶，以备浓度测定；蒸馏水回溶，以备浓度测定；另一支离心管加入另一支离心管加入5mL 10%5mL 10%的的 H H2 2SOSO4 4 ，然后将沉淀转入然后将沉淀转入50mL50mL三角瓶中，三角瓶中，待用。待用。 操作步骤操作步骤 注意配平、对称放置离心管注意配平、对称放置离心管生物化学实验-酵母RNA的分离组分鉴定及含量分析RNARNA的酸解的酸解将装有待测将装有待测RNARNA的三角瓶，在电炉上加热，至溶液透明为的三角瓶，在电炉上加热，至溶液透明为止，得到止，得到RNARNA的水解液，期间不停晃动，以使受热均匀。的水解液，期间不停晃动，以使受热均匀。 注意注意 RNARNA加热酸解时

9、，一定注意观察，本步很容易加热过度，加热酸解时，一定注意观察，本步很容易加热过度，使透明溶液变成黑褐色，而导致实验失败。使透明溶液变成黑褐色，而导致实验失败。5.RNA5.RNA的组分鉴定的组分鉴定生物化学实验-酵母RNA的分离组分鉴定及含量分析检验项目检验项目 嘌呤嘌呤 核糖核糖 磷酸磷酸 水水 解解 液液1mL1mL1mL1mL1mL1mL试试 剂剂NHNH3 3HH2 2O 2mL O 2mL AgNOAgNO3 3 1mL 1mL 苔黑苔黑FeClFeCl3 3 1mL 1mL 定磷试剂定磷试剂 1mL 1mL SnClSnCl2 2 1-2 1-2滴滴 反应条件反应条件 不振动不振动

10、观察现象观察现象沸水浴约沸水浴约10min10min振荡混匀振荡混匀室温放置室温放置现现 象象 白色絮状沉淀白色絮状沉淀 鲜绿色鲜绿色 兰色兰色 组分鉴定组分鉴定加蒸馏水将水解液稀释至加蒸馏水将水解液稀释至5mL5mL，然后按下表检验，然后按下表检验项目所需的量分装三支试管中，进行组分鉴定。项目所需的量分装三支试管中，进行组分鉴定。生物化学实验-酵母RNA的分离组分鉴定及含量分析待测样品适当稀释（如量取待测样品适当稀释（如量取100100L RNAL RNA水溶液，加水溶液，加29002900L L 蒸馏水混匀），用紫外分光光度计分别测定其蒸馏水混匀），用紫外分光光度计分别测定其230nm23

11、0nm、260nm 260nm 和和280nm 280nm 的吸光度值。的吸光度值。可根据自己的样品浓度调整稀释倍数。可根据自己的样品浓度调整稀释倍数。 黑体调零黑体调零 蒸馏水调蒸馏水调1001006.RNA6.RNA含量测定含量测定注意保护石英比色皿，轻拿轻放！注意保护石英比色皿，轻拿轻放！生物化学实验-酵母RNA的分离组分鉴定及含量分析配平：含液离心管与外套铁管在一起两组配平（先选两个配平：含液离心管与外套铁管在一起两组配平（先选两个外套铁管重量接近）对称放于离心机的铁套中。外套铁管重量接近）对称放于离心机的铁套中。设置：闭盖，选离心机设置键（设置：闭盖，选离心机设置键（“亮点亮点”在转

12、速和时间的在转速和时间的选择上：可通过三角符号移位，然后再增减），设置数都选择上：可通过三角符号移位，然后再增减），设置数都完成后再按确认键。完成后再按确认键。启动：使启动：使“亮点亮点”回到测定位置，按启动键。转动期间盖回到测定位置，按启动键。转动期间盖子打不开。子打不开。若声音很大异常。立即按停止键。若声音很大异常。立即按停止键。离心机的使用离心机的使用生物化学实验-酵母RNA的分离组分鉴定及含量分析通过实验现象说明鉴定的结果，由结果进一步说明通过实验现象说明鉴定的结果，由结果进一步说明你的提取物是什么？你的提取物是什么？计算计算RNARNA溶液浓度及酵母溶液浓度及酵母RNARNA得率，并判断样品纯度。得率，并判断样品纯度。将组分定性鉴定实验结果交老师过目评分，然后清将组分定性鉴定实验结果交老师过目评分，然后清洗离心管，整理实验台，用具归位