人淋巴细胞免疫反应性生长激素基因调控序列的克隆与鉴定

1、    人淋巴细胞免疫反应性生长激素基因调控序列的克隆与鉴定王辉邓洁英郑德先史轶蘩中国图书分类号R392.11摘要目的：克隆和鉴定人淋巴细胞免疫反应性生长激素(irGH)基因调控序列的核苷酸顺序。方法：通过PCR扩增出人淋巴细胞irGH基因5"近端的调控序列，然后将其与质粒PGEM7Zf(+)连接，经转化蓝白斑筛选、酶切鉴定，获得PGEM7Zf(+)-irGH DNA (-484-+2 bp)重组质粒，进行序列测定。结果：显示irGH基因5"近端的调控序列与垂体细胞GH基因的5"近端调控序列的核苷酸顺序完全相同。结论：该结果

2、进一步证明免疫系统与神经内分泌系统的密切关系。关键词生长激素基因调控序列人淋巴细胞Cloning and nucleotide sequencing of the 5"-flanking region of immunoreactive growth hormone gene of human lymphocyteWANG Hui,DENG Jie-Ying,ZHENG De-Xian et al. Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Me

3、dical College,Beijing 100730AbstractObjective：Cloning and nucleotide sequencing of the 5"-flanking region of immunoreactive growth hormone gene of human 1ymphocyte.Methods:The immunoreactive growth hormone(irGH) DNA fragments were obtained by PCR with normal human peripheral blood lymphocyte DN

4、A as template.Then,the plasmids of PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+2 bp) were constructed by ligation of irGH DNA with PGEM7Zf(+),transformation,blue/white color selection and restriction enzyme analysis.The 5"-flanking region of irGH were sequenced by using sanger's dideoxynucleitide chain-temin

5、ation reaction.Results:It was demonstrated that the sequence data of 5"-flanking region(-484-+2 bp) in irGH gene was identical to that of pituitary GH gene.Conclusion:The results indicate a close relationship between immune system and neuroencrine system.Key wordsGrowth hormone genePromoterLymp

6、hocytes已发现经典的内分泌腺体、神经元、神经胶质细胞能够产生多种细胞因子，中枢及外周免疫器官也能产生多种激素和神经肽，此外还证实免疫系统和神经内分泌系统的细胞能表达细胞因子、激素及神经肽的受体1。淋巴细胞能分泌免疫反应性生长激素(Immunoreactive GH，irGH)，它是淋巴细胞的一种自分泌和旁分泌生长因子，在抗原性、分子量、生物活性及mRNA大小等方面与垂体GH相似。本实验室证实人淋巴细胞表达的irGH cDNA编码序列与垂体hGH cDNA的序列是相同的2，3，但目前有研究表明淋巴细胞分泌GH与垂体分泌GH的调控机制是不同的。本实验室为了从分子水平上探讨淋巴细胞irGH基因

7、表达的调控机制，首先克隆irGH基因的5"上游调控序列，进行序列分析和鉴定。1材料与方法1.1菌株及质粒DH5及PGEM7Zf(+)质粒为本室保存。1.2试剂内切酶(SmaI、BamHI、EcoRI)、T4 DNA连接酶、Klenow大片段酶、Taq DNA聚合酶、Wizard PCR产物纯化系统、fmol DNA测序试剂盒均为美国Promeaga公司产品。DNA分子量标准DNA/EcoRI+Hind、PBR322/hinf为华美公司产品，PCR引物由北京赛百胜(美国)生物工程公司合成，32P-dATP为北京亚辉公司产品。1.3PCR引物的设计为了扩增irGH基因5"上游序

8、列，按照文献4设计出上游引物(P1)(-484-467 bp):5"-GACTGAATCGTGCTCAC-3"和下游引物(P2)(+441-+464 bp):5"-GGTGCAGACGATGGGCGCGGAGC-3"。1.4irGH基因(-484-+464 bp)片段的扩增取正常人抗凝外周血，分离出淋巴细胞，用酚抽提法分离DNA，纯化后取300 ng作模板，加2 mmol/L dNTP混合物2 l和引物P1、P2各200 pmol/L、2.5 U Taq DNA聚合酶，在50 l终反应体积中按以下方式进行PCR扩增；95，5 min；94，1 min，6

9、0，1 min，72，2 min，30个循环；72，10 min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后用Wizard PCR产物纯化系统回收。1.5irGH(-484-+464 bp)重组质粒的构建首先取3.0 g PGEM7Zf(+)加入SmaI 20 U，在20 l反应体系中，25水浴水解3 h。然后加入PCR扩增的irGH基因(-484-+464 bp)片段1.6 g加入5 U Klenow大片段酶、5 mmol/L dNTP 1 l。12水浴3 h，将irGH DNA片段两端补齐。然后加入0.1倍体积的3 mmol/L醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇，放入-20冰箱1 h，取出后4 离

10、心，12 000 r/min，30 min，去上清后冷冻干燥3 min，加入下列试剂：6 U T4 DNA连接酶、10×连接缓冲液2 l、SmaI 10 U、50% PEG8000 6 l，补足至20 l，16水浴过夜。然后取DH5a感受态细胞100 l，加入10 l连接缓冲液进行转化，而后在含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB琼脂培养基上进行蓝、白斑筛选，即为irGH(-484-+464 bp)重组质粒。1.6irGH DNA(-484-+2 bp)重组质粒的构建取数个白色菌落分别种入含有氨苄青霉素(50 g/ml)LB培养基的试管中，37振荡过夜，采用碱裂解法进行质粒的少量

11、提取，1%琼脂糖凝胶电泳，选出PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+464 bp)重组质粒，如图1所示用BamHI酶切、鉴定获得正确的克隆，即irGH (-484-+2 bp)质粒。1.7irGH基因5"上游核苷酸序列的测定以PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+2 bp)重组质粒为模板，用PUC/M13正反向引物行双链双脱氧DNA人工测序，按fmol测序试剂盒说明进行操作。  图1PGEM7Zf(+)-irGH测序质粒的构建Fig.1Construction of sequencing plasmid PGEM7ZF(+)-irGH2

12、结果2.1PCR扩增irGH基因片段(-484-+464 bp)结果PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳可见一大约900 bp的特异条带，该条带即为包括irGH 5"上游调控序列的DNA片段(-484-+464 bp)。2.2PGEM7Zf(+)-irGH DNA重组克隆的鉴定PGEM7Zf(+)和irGH DNA(-484-+464 bp)行平端连接后，经蓝、白斑筛选，获得数10个白色菌落。取其中8个白色菌落进行质粒少量提取，琼脂糖电泳分析表明3个质粒为含有irGH DNA(-484-+464 bp)的克隆。然后经BamHI酶切分析，如图2所示，质粒1、2切下的片段小(+3-+464

13、 bp)证明为正向连接，而质粒3切下的片段大(-484-+464 bp)为反向连接。然后将切下了小片段的质粒1、2用T4 DNA连接酶连接，即得到PGEM7Zf(+)-irGH DNA(-484-+464 bp)重组质粒。  图2重组质粒的琼脂糖电泳Fig.2Photogram of reconstructed plasmid digested with BamHI and analyzed by electrophoresis in agarose gel containing EB2.3irGH DNA 5"上游核苷酸调控序列的测定结果如图3，与垂体GH基因的调控序列是

14、一致的。-484GACTGAATCGTGCTCACAACCCCCACAATCTATTGGCTGTGCTTGGCCCCTTTTCCCAAC-424ACACACATTCTGTCTGGTGGGTGGAGGTTAAACATGCGGGGAGGAGGAAAGGGATAGGAT-364AGAGAATGGGATGTGGTCGGTAGGGGGTCTCAAGGACTGGCTATCCTGACATCCTTCTCC-304GCGTTCAGGTTGGCCACCATGGCCTGCGGCCAGAGGGCACCCACGTGACCCTTAAAGAGA-244GGACAAGTTGGGTGGTATCTCTGGCTGACACTCTGT

15、GCACAACCCTCACAACACTGGTGA-184CGGTGGGAAGGGAAAGATGACAAGCCAGGGGGCATGATCCCAGCATGTGTGGGAGGAGCT-124TCTAAATTATCCATTAGCACAAGCCCGTCAGTGGCCCCATGCATAAATGTACACAGAAAC-64AGGTGGGGGCAACAGTGGGAGAGAAGGGGCCAGGTATAAAAAGGGCCCACAAGAGACCAG-4CTCAAG图3人irGH DNA 5"上游调控核苷酸序列Fig.3Nucleotide sequence of the 5"-flanking

16、region of irGH gene of human lymphocytes3讨论Hiestand等于1986年首先报道了用大鼠的GH和PRL特异性的mRNA探针进行斑点杂交，发现激活的淋巴细胞胞浆中有GH和PRL的mRNA存在5，随后人们就irGH分子量的大小、mRNA的表达量及irGH的分泌等方面进行了研究，证明在胸腺、骨髓、外周血细胞及脾脏分离出的T和B细胞都可分泌irGH。Kao等研究发现GHRH、TRH、CRH、胰岛素、睾酮、雌激素、胸腺素-5、生长抑素、IGF-I、肾上腺素等均不影响淋巴细胞系H9细胞分泌irGH6，Hattori等报道外源性GH能增加植物血凝素(PHA)刺激的

17、人外周血淋巴细胞irGH的分泌，并且是剂量依赖性的，这表明淋巴细胞irGH和垂体GH的分泌调控机制是不同的7。刘军喜等对人外周血淋巴细胞的irGH cDNA及Rohn等对大鼠脾脏淋巴细胞的irGH cDNA分别进行了克隆和序列分析，结果证明淋巴细胞irGH cDNA与垂体GH cDNA的核苷酸序列完全相同2，3，并且Rohn还证明大鼠irGH的调控序列(-300 bp)与大鼠垂体GH基因调控序列是一致的8。有研究表明：人GH的289 bp调控序列就可满足垂体GH基因表达的需要9，为深入探讨irGH表达的调控机制，本研究首先对irGH基因5"上游调控序列(-484 bp-+2 bp)进

18、行了克隆和测序分析。垂体细胞表达GH主要受垂体特异性转录调控因子Pit-1蛋白影响，Pit-1蛋白结合GH基因的部位在5"上游调控序列-80 bp左右和-122 bp左右两个位点。目前尚不清楚为什么淋巴细胞irGH和垂体GH分泌调控不同。Gellersen等通过对Pit-1 mRNA的RT-PCR研究发现胸腺细胞、Jurkat淋巴瘤细胞及PHA刺激的外周血淋巴细胞均有较弱的Pit-1条带存在，并且Pit-1条带的强弱与这些细胞分泌催乳素(hPRL)的多少无关10，我们推测人淋巴细胞irGH和垂体GH表达调控机制不同的原因可能是：淋巴细胞受细胞因子的自分泌和旁分泌影响；淋巴细胞内调控G

19、H表达的Pit-1蛋白表达量太少，对irGH表达不起主要调控作用。要阐明淋巴细胞irGH表达的调控机理还需进行更深入的研究。本实验证明人外周血淋巴细胞分泌的irGH基因调控序列(+484-2 bp)与垂体GH相应调控序列是完全一致的，这为我们进一步探讨irGH分泌的基因调控机制和irGH对淋巴细胞功能的影响打下了良好的基础。人淋巴细胞免疫反应性生长激素基因调控序列的克隆与鉴定国家自然科学基金资助(39370340)人淋巴细胞免疫反应性生长激素基因调控序列的克隆与鉴定王辉河南新乡医学院免疫学教研室，新乡453003郑德先中国医学科学院基础医学研究所生化室，北京100005作者简介：王辉，男，33

20、岁，在职博士生，副教授，主要从事神经内分泌免疫学方面的研究；邓洁英，女，58岁，教授，博士生导师，主要从事垂体激素及疾病的基础研究作者单位：(中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院，北京100730)4参考文献1王辉，邓洁英，史轶蘩.淋巴细胞分泌的免疫反应性生长激素的研究进展.国外医学*免疫学分册，1997；20(4)：1962刘军喜，郑德先，邓洁英 et al. 人淋巴细胞免疫反应性生长激素mRNA的扩增与鉴定.中国医学科学院学报，1996；18(5)：3703刘军喜，郑德先，邓洁英 et al. 人淋巴细胞免疫反应性在生长激素cDNA的克隆、序列测定与人垂体生长激素cDNA的比较研究.

21、中华内分泌代谢杂志，1997；13(1)：34Chen E Y,Liao Y C,Smith D H et al.The human growth hormone locus; nucleotide sequence,biology,and evolution.Genomics,1989;4:4795Hiestand P C,Mekler P,Nordmann R. Prolactin as a modulator of lymphocyte responsiveness provides a possible mechanism of action for cyclosporine.Proc Natl Acad Sci USA,1986;83:25996Kao T L,Meyer W J. Inhibition of immunoreactive growth hormone secretion from lymphoid cell li