光学显微镜基础知识

1、基础知识基础知识显微镜成像显微镜成像FF物镜显微镜成像显微镜成像FF物镜显微镜成像显微镜成像物镜250mm明视距离FF目镜基础知识基础知识点 标本投影图像点 平面平面图形准确 相似 图形像差像差点 标本投影图像虚的圆 平面弯曲的面图形变形的图形像差像差基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识ACHPLAN ACH基础知识基础知识色差校正色差校正对照对照无校对 校对 基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识R = k /NA：波长：波长NA：数值孔径：数值孔径K常数常数: K光镜光镜 ；KFV基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识

2、基础知识基础知识基础知识比如10倍物镜下的中心转换到40倍是仍然几乎是中心基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识uVIS NIR范围内优异的色差校正范围内优异的色差校正信信噪噪UPLSAPO物镜物镜消色差消色差 Ach 蓝蓝 (486nm) 和红和红 (657nm)半复消色差半复消色差Fluorite 兰和红兰和红 + (绿绿, 紫色紫色(437nm)复消色差复消色差Apo 437-657nm 超级复消色差超级复消色差Super Apo 430-1000nm物镜的色差校正物镜的色差校正轴向色差轴向色差侧向色差侧向色差AC

3、H消色差消色差 Ach 蓝蓝 (486nm) 和红和红 (657nm)半复消色差半复消色差Fluorite 兰和红兰和红 + (绿绿, 紫色紫色(437nm)复消色差复消色差Apo 437-657nm 超级复消色差超级复消色差Super Apo 430-1000nm物镜的色差校正物镜的色差校正轴向色差轴向色差侧向色差侧向色差ACHFLIRIR消色差消色差 Ach 蓝蓝 (486nm) 和红和红 (657nm)半复消色差半复消色差Fluorite 兰和红兰和红 + (绿绿, 紫色紫色(437nm)复消色差复消色差Apo 437-657nm 超级复消色差超级复消色差Super Apo 430-10

4、00nm物镜的色差校正物镜的色差校正轴向色差轴向色差侧向色差侧向色差ACHFLApo消色差消色差 Ach 蓝蓝 (486nm) 和红和红 (657nm)；绿球差；绿球差半复消色差半复消色差Fluorite 兰和红兰和红 + (绿绿, 紫色紫色(437nm)；绿、兰球差；绿、兰球差复消色差复消色差Apo 437-657nm ，绿、兰、深兰球差，绿、兰、深兰球差超级复消色差超级复消色差 430-1000nmSuper Apo物镜的色差校正物镜的色差校正轴向色差轴向色差侧向色差侧向色差ACHFLS ApoIRIRApo基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识浮雕相称物镜浮雕相

5、称物镜无应力偏光物镜无应力偏光物镜相称物镜相称物镜超低倍物镜超低倍物镜基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识基础知识光阑全开启光阑全开启光阑适当关小光阑适当关小荧光观察中应用荧光观察中应用基础知识基础知识基础知识基础知识聚光镜聚光镜瞳距调节瞳距调节屈光度调节屈光度调节调节调节光光路路转转换换孔径光栏调节孔径光栏调节N.A聚= =(0 0.6-06-0.8 8)N.A物孔孔径径光光栏栏开开度度与与图图象象100%70%30%HRLCHCLRMRMC孔径光栏的运用孔径光栏的运用孔径光栏的运用孔径光栏的运用对比度调节对比度调节显微镜无限远光学系统显微镜无限远光学系统UIS UIS 有限远有限远无限

6、远无限远 UISUIS光学系统Merit of the Infinity system 物镜 D/M 重影 平行光线平行光线 结像透镜UIS 系统 Universal Infinity System万能无限远系统万能无限远系统1. 完美结合分辨率和对比度 -明场高分辨率-高对比度、高亮度图像-清晰的 DIC图像-更敏感的偏光观察-清晰、色彩明亮的相衬UIS 系统Universal Infinity System2. 系统灵活性- 无限远校正光学系统- 物镜和结像透镜完全校正3. 物镜万能性更强-A single universal objective lens performs very we

7、ll in Fluorescence, Nomarski DIC, Phase contrast, Polarized light and, of course, Brightfield-High UV transmission, Strain-free, Perfect correction of Chromatic aberration and other optical aberrationsCompetition comparison F : Fully Primary Correction in objective & tube lens Tc : Tube-lens Com

8、pensation增加附件，光路不变，倍率不变，增加附件，光路不变，倍率不变，F.N.不变不变中间附件设计更简单，不需增加透镜中间附件设计更简单，不需增加透镜物镜单独完成象差校正，象差校正更高，不需目镜补偿物镜单独完成象差校正，象差校正更高，不需目镜补偿更高镜像亮度，荧光效果更好（结象透镜校正）更高镜像亮度，荧光效果更好（结象透镜校正）接视频效果更好，不需增加照相目镜接视频效果更好，不需增加照相目镜相差观察方式相差观察方式1 原理原理利用被检物体的光程（折射率 x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差共轭面：吸收光线，直射光通过共轭面：吸收光线，直射光通过补偿面：

9、相位推迟，衍射光通过补偿面：相位推迟，衍射光通过物镜物镜相板相板 聚光镜环状光阑聚光镜环状光阑相差观察方式相差观察方式2 特点特点鉴定活体细胞最实用、最经济的方法3 缺点缺点需要光强高切片不能太厚(210um)盖片、载片需符合标准最好配用单色滤光镜操作较麻烦荧光效果不如明场物镜相差观察方式相差观察方式4 应用：应用：无色透明活体标本的细微结构，检查,鉴定活体细胞(培养细胞,分离细胞)相差观察方式相差观察方式5 调节：调节：柯勒照明调节将相差物镜及附件转入光路（物镜聚光镜相衬环型号匹配）对样品聚焦取下目镜，装上CT望远镜，调节CT焦距看到清晰的相差环调节聚光镜上定位螺丝，使环状光阑象与相板共轭面

10、重合荧荧光光观观察察方方法法什么是荧光什么是荧光 ? ? 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光温度辐射光冷光。即：物质吸收短波光，发冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。射出的长波光。 显微镜荧光利用光源激发显微镜荧光利用光源激发光化荧光光化荧光荧光显微镜的作用原理宽谱线发射光宽谱线发射光（汞灯）（汞灯）滤掉其他光，透过滤掉其他光，透过激发光激发光激发滤激发滤色片色片吸收滤吸收滤色片色片滤掉激发光，透过滤掉激发光，透过荧光荧光标本受激发产生标本受激发产生

11、荧光向四周发散荧光向四周发散激发光受反射、折射激发光受反射、折射或衍射向四周发散或衍射向四周发散荧光的性质荧光的性质 吸收光，必需有激发光源吸收光，必需有激发光源 荧光波长激发波长（损失热能）荧光波长激发波长（损失热能） 荧光强度极小于激发光的强度荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率度、荧光效率荧光显微镜的优点和用途荧光显微镜的优点和用途优点：优点： 检出能力高（放大作用）检出能力高（放大作用） 对细胞的刺激小（可以活体染色）对细胞的刺激小（可以活体染色） 能进行多重染色能进行多重染色用途

12、：用途： 物体构造的观察物体构造的观察荧光素荧光素 荧光的有无、色调比较进行物质判别荧光的有无、色调比较进行物质判别抗体抗体荧光等荧光等 发荧光量的测定对物质定性、定量分析发荧光量的测定对物质定性、定量分析荧光显微镜的主要部件荧光显微镜的主要部件 透射式透射式吸收滤色镜吸收滤色镜暗场聚光镜暗场聚光镜激发滤色镜激发滤色镜汞灯光源汞灯光源 落射式落射式吸收滤色镜吸收滤色镜分光镜分光镜激发滤色镜激发滤色镜汞灯光源汞灯光源落射荧光显微镜的构造落射荧光显微镜的构造落射荧光显微镜的构造落射荧光显微镜的构造荧光显微镜光源荧光显微镜光源 汞灯光源汞灯光源: :提供激发光提供激发光(U(U、V V、B B、G)

13、 G) 氙灯光源：氙灯光源： 高峰值更宽，更稳定高峰值更宽，更稳定荧光显微镜激发透镜组荧光显微镜激发透镜组 激发激发滤色镜滤色镜: : 激发波长选择激发波长选择 激发透镜组激发透镜组（激发块）（激发块）: : T%nmBAND PASS入射光入射光发射光发射光激发激发 滤色镜滤色镜分光分光 滤色镜滤色镜吸收吸收 滤色镜滤色镜落射荧光显微镜各部件特性和落射荧光显微镜各部件特性和作用作用 吸收滤色镜吸收滤色镜: :荧光透过荧光透过, ,阻挡杂光阻挡杂光 分色镜分色镜: :反射激发光反射激发光, ,荧光透过荧光透过A 透过透过AA 反射反射BB 透过透过B 阻挡阻挡nmnmT%T%A滤色镜的选择滤色

14、镜的选择荧光素荧光素激发波长激发波长 发射波长发射波长DAPI372372456456AMCA350350450450Hoechst 33258365365465465FITC490490520520Acridine Orange490490590590Acridine Yellow470470550550CY3552552565565TRITC541541572572Propidium Iodide530530615615带宽对图象的影响带宽对图象的影响SWB: BP420-480SWB: BP420-480WB: BP450-480WB: BP450-480WIB: BP460-490WIB: BP460-490NB: BP470-490NB: BP470-490双重染色标本的单色和双