肺腺癌患者血清生物标志物的筛选研究

1、    肺腺癌患者血清生物标志物的筛选研究            作者：王文静，项翠琴陆晔时间：2007-11-22 11:44:00                     【摘要】 目的 采用SELDI-TOF-MS技术探讨肺腺癌患者血

2、清蛋白标志物，并建立一个稳定、简便、快速的实验方法。方法 肺腺癌患者321例和正常对照人群321例，按照年龄、性别、吸烟史的有无进行1:1配对，采用WCX2芯片技术进行血清蛋白质组学研究，用蛋白芯片阅读器PBSII对芯片进行扫描、分析。结果 肺腺癌患者血清蛋白图谱与正常对照组相比，存在15个差异表达蛋白（P<10-5），其中包括11个高表达蛋白，分子量分别是1860Da、4055Da、4195Da、4211Da、4959Da、5329Da、5980Da、6313Da、6880Da、7762Da、9281Da，4个低表达蛋白，分子量分别是2564Da、2932Da、3082Da、3442D

3、a。显著高表达的潜在标志物5个，相对分子量分别为4055Da、4211Da、4959Da、5329Da和7762Da，以峰值比1.5为界值时， 其诊断肺腺癌的灵敏度分别为90.41%、78.08%、50.68%、57.53% 、72.60，特异度分别为97.06%、93.44%、71.15%、76.36%、94.92，选用4055Da、4211Da、4959Da、5329Da和7762Da建立决策树模型对样品进行筛选验证，其准确率为85.00%，灵敏度为86.67%，特异度为83.33%。结论 用该技术能筛选出灵敏度和特异性较好的差异表达蛋白，为肺腺癌的早期发现提供了一种新的、无创伤的实验方法

4、，可能具有较好的临床应用前景。     【关键词】 肺腺癌；生物标志物；SELDITOFMS；蛋白质组学     The screening study on lung adenocarcinoma serum biomarkers by SELDI-TOF-MS    【Abstract】 Objective To select relative specific biomarkers in serum from lung adenocarcinoma patients using surfa

5、ce-enhanced laser desorption and ionization time of flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) protein chip technology.Methods Serum samples from 321 lung adenocarcinoma patients， 321 healthy volunteers with matched gender， age and history of smoking were analyzed using WCX2 potein chip to screening po

6、tentially biomarkers. Proteomic spectra were generated by mass spectrometry.Results Five highly expressed potential biomarkers were identified with the relative molecular weights of 4055Da， 4211Da， 4959Da， 5329Da and 7762Da. The sensitivity for diagnosing lung adenocarcinoma was 90.41%， 78.08%， 50.6

7、8%， 57.53%， 72.60%; and specificity was 97.06%， 93.44%， 71.15%， 76.36%， 94.92%， when the critical point was made 1.5. The sensitivity for diagnosing lung adenocarcinoma was 86.67%， and specificity was 83.33% by applied to this protein fingerprints pattern validation.Conclusion SELDI-TOF-MS protein c

8、hip technology is a quick， easy， convenient， and high-throughput analyzing method capable of selecting several relatively specific， potential biomarkers from the serum of lung adenocarcinoma patients and may have attractive clinic value.    【Key words】 lung adenocarcinoma; biomarkers;

9、 SELDI-TOF-MS; proteomics    肺癌是目前全球发病率最高的恶性肿瘤之一，对人类健康的危害日益严重。目前，肺癌早期诊断困难。80%肺癌患者就诊时已属晚期， 失去了手术根治的机会，放疗化疗效果不佳， 5年生存率不到15%；而早期肺癌手术后5年存活率达70%1，但肺癌早期确诊率只有约15%，故肺癌总的预后不良，与肺癌缺乏有效的早期诊断手段有关。因此，寻找灵敏度、特异性高的早期诊断方法是目前临床亟待解决的问题之一。    蛋白质组学作为后基因组学时代的重要研究工具，在肿瘤研究中已广泛应用。表面增强激光解析离子化飞行时

10、间质谱技术（surface-enhanced laser desorption Ionization time of flight mass spectrometry， SELDI-TOF-MS）是一种新兴的蛋白质组学研究技术。使用这种技术，组分复杂的生物样品(如细胞液或体液)中的各种蛋白质通过特定的表面基团吸附于蛋白质芯片上，用激光脉冲辐射使结合在芯片上的蛋白质解析形成荷电离子，这些不同质荷比的离子在真空电场中飞行的时间长短不同，据此绘制出质谱图，可以简便、快速地获得各种蛋白质的分子量、丰度等信息。本研究使用SELDI技术，检测已明确诊断肺腺癌的患者血清样本，绘制蛋白质质谱图，分别与正常人进

11、行比照，筛选出肺腺癌显著高表达的潜在标志物5个，并建立决策树模型对样品进行筛选。寻找肺癌发生发展的生物标志物，从而为肺癌的早期诊断提供新的依据。    1 对象与方法    1.1 研究对象    1.1.1 样本来源 来自上海长征医院等收治的肺腺癌患者321例，其中男187例，女134例，平均年龄60.25±11.58岁(2976岁)。321例肺腺癌患者均手术后病理证实为肺腺癌。所有肺腺癌患者于术前抽取清晨空腹前臂静脉全血5ml。正常人群321例，男167例，女154例，平均年龄60.23&#

12、177;7.53岁(2876岁)， 均为无疾病证据的医务人员及健康体检者。分别抽取清晨空腹前臂静脉全血5ml。    1.1.2 实验分组 642例样品中，100例（50例患者、50例对照）用于检测后建立决策树模型，随机抽取60例（30例患者、30例对照）用于建模后的筛选研究。    1.2 方法    1.2.1 血清标本制备 上述所有肺腺癌患者和正常志愿者的静脉血标本，于4下3000转/min离心10min，取血清，分装后保存于80冰箱。    1.2.2 蛋白质芯片检测

13、 （1）平衡芯片：取50mmol/L pH=3.0的醋酸钠（NaAc）溶液200l/孔加入芯片的加样孔中，平衡芯片2次，每次5min。（2）血清样品稀释：取6l血清样品，加入234l 50mmol/L pH=3.0的NaAc溶液中，混匀稀释。（3）芯片上样：取稀释后的血清样品200l/孔加入芯片的加样孔，置芯片于摇床混匀90min。（4）样品洗脱：取50mmol/L pH=3.0的NaAc溶液200l/孔加入芯片加样孔，洗脱2次，每次5min。取300l/孔的去离子水冲洗芯片。（5）蛋白质获能：取能量吸收剂SPA（含饱和芥子酸溶于50 %乙腈和0.15 %三氟乙酸）1l/孔加入芯片加样孔，待自

14、然挥发后再重复加能量吸收分子SPA1次。所有操作均应在4条件下进行（插入碎冰中）。(6)芯片检测:将芯片置入Protein Chip Biomarker System 质谱仪处理， 以激光强度160， 作用时间90ns，经计算机形成血清蛋白质质谱图（其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比，见图1）。    1.2.3 数据处理 用Ciphergen Protein Chip软件和BioMarker Wizard软件对芯片检测得到的蛋白质相对含量及蛋白质质荷比数据进行处理，所有测得的蛋白质图谱进行统一标准化。采用Biomarker Pattern Software建立决策树模型。两组间蛋白峰相对强度值的比较应用t检验进行统计分析。    2 结果    2.1 肺腺癌患者与正常人群血清中蛋白质波谱峰的比较 肺腺癌患者与正常人血清差异表达蛋白筛选情况，见图2。    2.2 差异表达蛋白质诊断肺腺癌的价值评价 筛选出的五个肺腺癌差异表达蛋白质波峰的相对分子量分别为4055Da、4211Da、4959Da、5329Da、7762Da， 分别以峰值比1.5为界值时， 其诊断肺腺癌的灵敏度分别为90.41%、78.08%、50.68%、57.53%、7