肝细胞内源性β-葡萄糖醛酸酶与胆红素结石关系的免疫电镜研究

1、    肝细胞内源性-葡萄糖醛酸酶 与胆红素结石关系的免疫电镜研究        【摘要】目的了解内源性-葡萄糖醛酸酶(-G)与胆 红素结石 的关系。方法应用免疫电镜胶体金探针技术对胆红素结石组与健康对照 组人肝细胞溶酶体内源性-G进行定量比较研究。结果胆红素结石组( n=28)肝细胞溶酶体-G测定为(16.5±4.3)个/m2，明显高于健康对照组(n =30)-G测定(10.1±2.9)个/m2(P0.01)；两组同性别个体间比较差异亦有 显著

2、意义(P0.01)。胆红素结石组内不同个体-G测定与年龄、性别、结石大小、 病程长短、腹痛、黄疸、发热等因素均无关(P0.05)。结论内源 性-G作为人体内活性酶，在胆红素结石及健康人间存在着差异，与胆红素结石的形成密 切相关。【关键词】胆红素结石免疫电镜-葡萄糖醛酸酶肝细胞溶酶体Immunological electron microscopic study on relationship between hepatocytic endogenous -glucuronidase and pigment stone formationYANG Bo, ZHU Shande, ZHAO Yon

3、gguang. Military Region, et al. Department of Hepato biliary Surgery, General Hospital of Shenyang, Shenyang 110015【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between end ogenous -glucuronidase (-G) and formation of pigment stones. Methods Comparison was made for number of lysozymes counted b

4、y immunological e lectron microscopy and colloid gold probe in human hepatic cells between patient s with pigment stones and healthy controls. Results-G granul ations in hepatic cells were 16.5±4.3/m2 in the pigment stone group and wer e 10.1±2.9/m2 in the control gone (P0.01). The differe

5、nces of the amount of -G granulations were not significant when the patients with pigmen t s tones were subdivided by age, sex, size of stones, duration of illness, abdomina l pain, jaundice, fever (P>0.05). ConclusionsThe amount of e ndogenous -G is significantly different between patients with

6、pigment stones and healthy controls, and this might be closely related to the formation of pigm ent stones.【Key words】Pigment stoneImmunological electron microscop ey-glucuronidaseHepatocytic lysozyme胆道感染时细菌繁殖产生大量外源性-葡萄糖醛酸酶(-G)，水解结合型 胆红素成非结合型胆红素，后者与高分子物质及钙质结合致石的胆红素结石细菌酶解学说已 被公认1，2。近年来有国外学者提出，人体组织自身内

7、源性-G的质和量与胆 红素结石形成有关3。本文选取正常人及胆红素结石肝细胞为研究对象，参照肝 细胞研究模型4，应用免疫电镜技术对其关系进行探讨，旨在寻找形态学证据。 材料与方法1.实验对象：胆红素结石组：经病理检查证实的肝内外胆管胆红素结石肝组织标本 28例，男18例，女10例，年龄2278岁，平均42.5岁。健康对照组：正常活检肝组织标本3 0例，男16例，女14例，年龄2469岁，平均40.8岁。二组间性别，年龄分布比较，差异无 显著意义(P0.05)。以上病例为1995年至1998年沈阳地区部分医院住院病人。2.标本制备：留取新鲜组织标本，分别切成1 mm3小组织块，立即投入Carson

8、-Millong液 中固定4 h，PBS液冲洗数次，逐级乙醇脱水，White树脂包埋。低温聚合，超薄切片机 下制成7080 nm连续切片，贴附于镍网上，各取2张，随机分成对照组和实验组，每组56 张。浸湿的镍网室温下在1100兔抗人多克隆抗-G抗体(美国阿拉巴马大学Ho KJ教授 惠赠中孵育2 h，行第抗体染色，PBS液冲洗后，125羊抗兔15 nm胶体金抗体再染色1 h ，行第抗体标记，再行铀-铅复染，彻底冲洗后，CM10型透射电镜观察。对照组中不加 抗，用蒸馏水代替抗，其余实验条件与实验组相同。具体方法参照文献4。3.计数与统计方法：计数方法参照Weidener等5法，随机拍照10个任意分

9、布区， 照片最后同样放大27?500倍，再输入IPS-500型像分析仪处理，以1 m2为单位 ，测取肝细胞溶酶体内金标颗粒的数目。统计学处理：选取t检验。结果胆红素结石及健康对照组，两组两性肝细胞溶酶体内-G测定，见表1。表1两组两性肝细胞溶酶体-G测定结果及 比较组别例数金颗粒计数(个/m2)±s男女合计 男女合计胆红素结石组18102816.8±4.416.2±4.216.5±4.3健康对照组16143010.1±2.910.1±2.810.1 ±2.9两组比较:t5.17*4.28*6.69* P0.01无论男、女，两

10、组间肝细胞溶酶体-G均以结石组高于对照组，差异有极显著意义，均P 0.01。胆红素结石组内不同因素与内源性-G关系比较见表2。表2胆红素结石组不同因素与-G间相互关 系比较不同因素例数金颗粒计数(个/m2)t值性别男女181016.8±4 .416.2±4.20.351年龄(岁)42.542.5121617.0±4.616.1±4.00 .553结石大小(cm)1.51.5171116.4±4.416.8±4.70 .229病程(年)31.5141415.8±4.217.0±4.80.704腹痛无有52317.3&

11、#177;4.815.6±4.20.802黄疸指数(U)202020816.4±4.316.8±4.40.221发热()37.037.019915.2±3.817.2±4.9 1.185均P0.05讨论免疫电镜技术是先进的微观形态学研究方法，其胶体金探针具有特异性强，分辨率 高，准确定位，精确定量的特征，应用肝细胞研究模型对细胞内活性物质-G进行形态学 研究，具有重要意义。有研究表明，-G是哺乳动物体内组织及体液中的酸性水解酶，完成如下生理功能：第一 ，与类固醇激素的结合作用；第二，对结合的葡萄糖醛酸苷的水解作用；第三，参与细胞的 增生6。其中

12、-G对结合的葡萄糖醛酸苷的水解作用与胆红素结石形成关系密切 。人体-G有内源性和外源性之分，其中外源性-G，即胆道感染细菌繁殖产生的-G ，在胆红素结石形成中所起作用已得到肯定。细菌酶解学说认为，胆红素结石形成与胆道感 染细菌繁殖产生外源性-G的量，作用的内环境(如pH，最适为7.0)，以及其抑制物的量 与程度有关1。关于内源性-G，Ho等3认为是机体自身组织细胞产 生，合成并分泌的，所有哺乳类组织均存在，其中肝脏特别丰富。它的最适pH为4.6，在适 宜情况下，也能水解胆汁中的结合型胆红素，因而结石可以在胆总管及肝内胆管中形成并增 大。目前内源性-G质与量与胆红素结石形成是否有关，国内外学者尚

13、无统一认识。本文 作者应用免疫电镜技术对肝细胞溶酶体内-G进行定量研究是内源性-G与胆红素结石成 因关系形态学研究的初次探讨。实验结果表明，内源性-G在正常人肝细胞及胆红素结石病人肝细胞溶酶体中含量测定差 异有非常显著意义，即胆红素结石个体比正常人体内源性-G含量增高。实验结果还表明 ，在胆红素结石不同病人个体间内源性-G含量与其性别、年龄、结石大小、病程长短及 腹痛、黄疸、发热等因素均未见明显关系。本研究以形态学依据表明，内源性-G作为人体内一种活性酶，是胆红素结石形成的相关 因素之一。提示：人类不同个体间内源性-G含量的差异，可能与胆红素结石的形成密切 相关。基金项目：辽宁省自然科学基金资

14、助(962252)项目作者单位：杨波(110015沈阳市，沈阳军区总医院肝胆外科)朱善德(110015沈阳市，沈阳军区总医院肝胆外科)赵永光(110015沈阳市，沈阳军区总医院肝胆外科)岳辉(110015沈阳市，沈阳军区总医院肝胆外科)杜晓炬(110015沈阳市，沈阳军区总医院肝胆外科)李荫山(110015沈阳市，沈阳军区总医院肝胆外科)张弘(中国医科大学病理教研室)于众(中国医科大学病理教研室)于安民(中国医科大学病理教研室)参考文献1，黄志强.原发性肝胆管结石症.吴阶平，裘法祖，主编. 黄家驷外科学.第5版.北京：人民卫生出版社，1994.1393-1395.2，高静涛，裴德恺.胆道的病理

15、生理学.施维锦，主编.胆道外科学.上海：上 海科学技术出版社，1993.52-54.3，Ho KJ. Pathogenesis of the formation of pigment gallstones. The role of human biliary -glucuronidase. Med Today, 1992, 159:694-697.4，杨波，朱善德，杜晓炬，等.人肝细胞超微结构-葡萄糖醛酸酶分布的 定位定量研究及意义.中华实验外科杂志，1996，13：342-343.5，Weidener Noel, Semole JP, Welch WR, et al. Tumor angiogenesis an d metastasis