重庆大学考研分子生物学题库+答案

1、2010年 高等分子生物学高级分子生物学1.试述利用基因工程的技术调控基因表达的主要方法答：（1）、基因表达系列分析技术基因表达系列分析技术是一种以测序为基础定量分析全基因组表达模式的技术，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。其基本原理是根据理论上任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特意序列，因此，选择特定的限制性内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性的9-10个碱基的核苷酸序列并制成标签连接、克隆测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。（2）、RNA选择性剪切机制RNA的选择性剪切是指用不同的剪切方式(选择不同的剪切位点组合)从一个m

2、RNA前体产生不同的mRNA剪切异构体的过程。一般将选择性剪切分为如下几类：平衡剪切、5选择性剪切、3选择性剪切，外显子遗漏，相互排斥性剪切。可以RT-PCR的方法研究一个基因是否存在选择性剪切。其步骤是：首先以cRNA两端特异性引物或来自不同外显子的引物序列在不同组织来源的RNA样品中进行扩增，观察PCR产物大小是否存在差异。如果发现差异，测序后可以分析出这种差异是否来自于选择性剪切。选择性剪切使一个基因翻译为多种蛋白质序列，是基因表达多样性的重要表现形式。（3）、原位杂交技术原位杂交(In Situ Hybridization,ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组

3、织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。通常可以分为RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类：1、RNA原位杂交 用放射性或非放射性(如地高辛、生物素等)标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可以通过检测放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物在细胞水平上作出定性定量分析；2、荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)技术首先对于寡核苷酸探针做特殊修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确

4、定该DNA序列在染色体的位置。FISH技术不需要放射性同位素，实验周期短，检测灵敏度高。（4）定点突变技术定点突变是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。但目前为止选择氨基酸突变的位点存在一定的盲目性。主要是采用两种PCR方法来实现：重叠延伸技术和大引物诱变法在基因序列中进行定点突变。（5）RNAi技术RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRN

5、A，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。其过程一般为：在Dicer的参与下，细胞中的双链RNA首先被降解形成21-25个核苷酸的小片段双链RNA(siRNA)，然后又siRNA中的反义链指导合成一种被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的核蛋白体，再又RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰基因表达的功能。同时，siRNA可作为特殊引物，在依赖于RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA为模板合成dsRNA，后者又可被降解为新的siRNA，重新进入上述循环。（6）一些基本分子生物学手段在启动子上游构建增强子、细菌培养时加入诱导物诱导产物生

6、成等。2.论述原核生物和真核生物基因表达调控的异同答：总体来说，真核生物基因组大,染色体数量多,且结构复杂,存在基因家族和断裂基因；原核生物基因组小,染色体数量少,结构简单,有重叠基因和操纵子结构，基因表达调控可以在复制、扩增、基因激活、转录、转录后、翻译和翻译后等多级水平上进行,但转录水平调控是主要的。如何实施调控,二者差距明显。真核生物,激素水平和发育阶段是基因表达调控的主要手段,而营养条件和环境因素的影响力大为下降。真核基因表达以正性调控为主导，基因的转录与染色质的结构变化相关,真核基因转录发生在细胞核(线粒体基因的转录在线粒体内),需对内含子精确剪接加工，翻译则多在胞浆,两个过程是分开

7、的。基因表达调控的环节比原核生物更多。原核生物中,营养条件和环境因素对基因表达调控起举足轻重的作用，mRNA在形成过程中与核糖体混合在一起,如细菌。所以细菌的转录和翻译几乎发生在同一时间间隔内,转录和翻译相耦联。详细分析其特点如下：原核生物的基因表达调控特点1.转录水平的调控无论原核生物还是真核生物的基因调控主要是转录水平的,原核生物不同于真核生物的基因结构,存在转录单元,即操纵子，原核生物的转录受操纵子控制。1.1 RNA聚合酶与启动子的影响DNA转录RNA合成起始时,只有带有因子的全酶才能专一地与DNA上的启动子结合，因子能提高酶辨认启动子的能力，若启动子与聚合酶结合紧密,则基因获得较高水

8、平的转录,否则,转录水平较低，另外,还发现有些基因有增强子，位于转录起始的上游,是强化转录起始的序列。1.2代谢产物的调控可诱导调节：在代谢产物或化合物的诱导下,使基因活化,操纵子由关闭状态转为工作状态，如大肠杆菌的乳糖操纵子：无诱导物存在时，阻遏物与操作基因结合使得结构基因不能正常转录；诱导物（乳糖或IPTG）存在，与阻遏物结合时，阻遏物从操纵基因上脱离下来，RNA聚合酶便可通过启动子和操作基因正常转录出一条多顺反子mRNA从而翻译得到三种酶。可阻遏调节：基因转录平时是开启的,但由于某些特殊代谢产物或化合物的积累将其关闭,阻遏基因的转录,不能合成蛋白质或酶。如大肠杆菌的色氨酸操纵子：trp操

9、纵子转录起始的调控是通过阻遏蛋白实现的。产生阻遏蛋白的基因是trpR，它结合于trp 操纵基因特异序列,阻止转录起始。当Trp 水平低时,阻遏蛋白以一种非活性形式存在,不能结合DNA。这时 Trp 生物合成途径被激活；trp操纵子转录终止的调控是通过弱化作用实现的。在大肠杆菌trp operon,前导区的碱基序列包括4个分别以1、2、3和4表示的片段,能以两种不同的方式进行碱基配对, 1 - 2和3 -4配对,或2 - 3配对, 3 - 4配对区正好位于终止密码子的识别区。前导序列有相邻的两个色氨酸密码子,当培养基中Trp 浓度很低时,负载有Trp 的tR2NATrp也就少,这样翻译通过两个相

10、邻色氨酸密码子的速度就会很慢,当4区被转录完成时,核糖体滞留1区,这时的前导区结构是2 - 3配对,不形成3 - 4配对的终止结构,所以转录可继续进行。反之,核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子,在4区被转录之前,核糖体就到达2区,这样使2 - 3不能配对, 3 - 4 区可以配对形成终止子结构, 转录停止。1.3降解物对基因转录的调节细菌在有葡萄糖存在的培养基情况下,即使加入乳糖、半乳糖等诱导物,与其相应的操纵子也不会启动，这是由于葡萄糖抑制了细菌的腺苷酸环化酶,减少环腺苷酸(cAMP)的合成。当培养基中的葡萄糖减少时,则环腺苷酸的活力提高, cAMP的合成增加, cAMP与CRP形成复合

11、物并与操纵子结合,促进乳糖的表达。降解物的抑制作用是通过促进基因转录来正常调节基因表达的。1.4细菌的应急反应对基因表达的调控细菌在生存条件危急时,如氨基酸全面匮乏,细菌会产生一个应急反应:包括生产各种RNA、糖、脂肪、蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止，因为此时细菌细胞中存在大量不载氨基酸的tRNA,空载的tRNA激活焦磷酸转移酶,使鸟苷四磷酸(ppGpp)大量合成, ppGpp的出现会关闭许多基因·除ppGpp外,实施应急反应的额信号还有鸟苷五磷酸(pppGpp)·它们的作用十分广泛,影响一大批操纵子,是基因转录的超级调控因子。1.5亮氨酸的影响亮氨酸通过亮氨

12、酸反应蛋白Lrp对基因表达的激活或阻遏起调节作用，某些亮氨酸影响基因表达的操纵子，外加丙氨酸也有类似效果。2.原核生物基因的转录后调控2.1翻译起始的调控遗传信息翻译成多肽链起始于mRNA上的核糖体结合位点（RBS）。所谓RBS是指起始密码子AUG上有的一段非翻译区。在RBS中有SD序列，富含G、A，该序列与核糖体16SrRNA的3端互补配对，促使核糖体结合到mRNA上，有利于翻译的起始。此外，mRNA的二级结构也是翻译起始调控的重要因素。2.2稀有密码子的影响由于细胞内对应于稀有密码子的tRNA较少，高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。比如dnaG基因就是一个

13、很好的例子。2.3重叠基因的影响色氨酸操纵子由五个基因(trpE、D、C、B、A)组成，在正常的情况下,这五个基因产物是等量的。比较研究发现当trpE发生突变后,其临近的trpD的产量比下游的trpB、A要低，这是因为trpE基因的终止密码子和trpD的起始密码子之间共用了一个含碱基A核苷酸是重叠的，这种重叠的密码是保证同一核糖体对两个连续基因进行翻译的机制·而在trpC和trpB之间相隔11个核苷酸,因而没有这种机制。这种偶联翻译机制可能是保证两个基因产物在数量上相等的重要手段。2.4 ploy(A)对翻译的影响mRNA 3端ploy(A)的长短对翻译效率也有很大影响。细胞中蛋白质

14、合成旺盛时，mRNA链上的核糖体数量就多，mRNA链上的ploy(A)也较长。2.5 翻译的阻遏序列分析表明，有些位点能形成稳定的茎-环结构，具备翻译阻遏特征。2.6魔斑核苷酸对翻译的影响研究发现在缺少任何一种氨基酸的培养基中,不但蛋白质合成速率下降,而且RNA的合成也下降。后来又发现大肠杆菌突变株在色氨酸不足时,蛋白质合成停止,而RNA合成却没有下降。进一步研究发现前者能合成魔斑(ppGpp和pppGpp)，由于氨基酸缺乏,空载tRNA增多,空载tRNA在核糖体上将正常合成蛋白质需要的GTP合成魔斑，PpGpp可以大范围内作出应急反应,以控制核糖体和其它大分子的合成,活化蛋白水解酶。2.7

15、MicRNA对翻译的影响真核生物基因表达的调控的特点1 DNA染色质结构的调控真核生物存在DNA和染色质的调控作用,原核生物无此特点，即以核小体为单位的核蛋白结构，只有当紧密压缩的异染色质转变为松疏、伸展形式的常染色质,在基因控制区改变结构,产生DNase超敏感区,使基因激活,才能促进转录，组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转录,去除组蛋基因又能够转录，DNA碱基修饰变化,甲基化可能阻碍转录因子与DNA特定部位的结合从而影响转录。2转录调控2.1顺式作用元件的调控真核生物无操纵子以及与操纵基因相临的调节基因,但其转录受到与结构基因相距一定距离的特定顺式作用元件的影响如:增强子、启动子、位点控

16、制区。真核生物的启动子,在-25-35区含有TATA序列,在-70-80区含有CCAAT序列,在-80-110区含有GCCACACCC前者精确地保证转录起始;后两者控制转录起始的频率,不参与起始位点的确定，真核基因启动子区较大,转录成mRNA具有“帽子”结构，真核基因的增强子能使与它连锁的基因的转录频率明显增加，增强效应不受它在DNA上位置的影响,也不具有基因的专一性;但有严格的组织和细胞特异性,受外部信号的调控。2.2反式作用因子的调控真核基因转录还需相应的反式作用因子作用,是通过顺式作用元件与反式作用因子复杂的相互作用实现的，反式作用因子主要是一些调控蛋白,不具有基因的特异性，另外,还有一

17、些转录因子能与某个(类)蛋白质因子结合,控制基因特异性表达的上游序列,如:热激活应答元件HSE,糖皮质应答元件GRE,金属应答元件MRE等,这些应答元件与细胞内高度专一的转录因子相互作用,协调基因的相关转录。真核生物的DNA能根据发育阶段的需要,以基因丢失、拷贝数扩增、基因重排与移位等方式的进行发育调控,这种调控是可逆的,可从根本上改变某些细胞的基因组。2.3激素水平的调控真核生物基因表达的激素调节相当于原核生物对环境变化所作出的反应。激素由细胞产生,再运送到靶细胞内实施调控。许多激素的调节作用是启始转录，激素调节具有很强的组织特异性。3 RNA对基因表达的调控tRNA,rRNA,mRNA为蛋

18、白质翻译所必需，真核生物的前体tRNA先要经过核苷酸的修饰,生成4、5sRNA,再剪接为成熟的4sRNA、前体rRNA须经过核糖甲基化才能成熟;而原核生物的rRNA主要是碱基化。真核生物转录产生的mRNA,需进行一系列的加工,才能生成成熟的mRNA，包括mRNA5端加“帽子”, 3端加poly (A),以及内含子的精确剪接加工,原核生物却无此特点。此外, mRNA还会进行核苷酸的替换、插入、删除等编辑修饰,改变DNA模板的遗传信息。4翻译调控4.1翻译起始的调控真核生物具有“帽子”结构,翻译效率受到“帽子”的制约，“帽子”结合蛋白CBP具有促进mRNA翻译蛋白的活性，但在高盐溶度下,有“帽子”

19、的mRNA的翻译能力严重受阻。许多可溶性蛋白因子的修饰会影响翻译起始。4.2翻译延伸的调控翻译起始后,核糖体并非一定能从起始密码顺序移至终止密码,mRNA编码区也会形成一些二级结构,使翻译速率下降,甚至中途停止。另外,3端的poly(A)的长短、以及与rRNA的互补性也影响翻译水平。4.3蛋白质的加工成熟翻译初生的原始蛋白质大多无生物活性,必须经过一系列加工才能成为有活性的蛋白质。这些加工包括切割多肽、多肽的有限水解、多肽的化学修饰(如:鳞酸化,糖基化)、多肽的剪接。3.举出三种基因文库的构建中对重组质粒的筛选方法并解释其原理答：重组DNA转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，以区别转化子与

20、非转化子、重组子与非重组子以及鉴定所需的特异性重组子。在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化；即使获得转化细胞，也并非都含有目的基因，所以需采用有效方法进行筛选。筛选的方法包括：根据遗传表型筛选（包括抗生素平板筛选和互补筛选等）、限制性内切酶分析筛选、核酸探针筛选、免疫学筛查法、菌落PCR筛选法、DNA-蛋白质相互作用筛选法、DNA序列分析等。1.抗生素平板筛选其原理是：目标基因是Kan的抗性基因，而载体含Amp 的抗性基因，因此在含有Amp 和Kan的培养基中生长的菌落即为阳性菌落。大概步骤包括：首先制备含有Amp 和 Kan 的LB琼脂培养

21、板 ； 然后将转化菌液涂布于含有Amp 和Kan培养板上，37培养；最后在含有Amp和Kan培养板上能生长的菌落即为阳性重组质粒，并将其接种于含Kan的LB液体培养基继续培养。小量制备质粒，限制性酶切分析进一步鉴定。2.互补筛选（蓝白斑筛选）适用于含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的载体，如 pUC系列等，其原理是：载体含有LacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点。当这种载体进入可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞后（质粒和宿主细胞编码的片段各自都没有酶活性），它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫互补。

22、由互补而产生的 Lac+ 细菌在呈色底物 X-gal和诱导剂IPTG存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无互补能力的氨基端片段。因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。通过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析，即可确定这些质粒的结构。3.菌落PCR该方法是以转化菌单个克隆为模板，采用特异性引物或通用引物对目的基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳等手段来鉴定筛选阳性转化子，最后可以经提取质粒DNA进行酶切和质粒PCR双重鉴定以及测序分析进一步确认菌落PCR的结果。实验中细菌经过94变性以后，大

23、部分细胞破裂，释放出其DNA，因此可将其细菌直接作为PCR反应的模板，而不需要抽提、纯化质粒DNA。由于这种方法直接以菌落为模板,不需要进行任何特殊处理,并可以快速、特异、有效地对大批重组克隆筛选进行筛选，适合于各种载体，应用广泛。4.杂交探针技术在基因文库的构建中，制备好合适的文库后，如果用可获得目的基因的互补DNA或RNA做探针，就可以利用核酸杂交技术鉴定出特定的重组体克隆。其原理是：任两条单链核酸分子都有相互形成碱基对的趋势。但形成的大多数分子对由于只有少数链间氢键形成，杂交结构并不稳定。但如果多聚核苷酸链是互补的，碱基对的大量形成使双链分子稳定。杂交探针技术的基本步骤：首先把菌落或噬菌

24、斑转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，处理除去杂质，只留下DNA。通常以上处理步骤同时会使DNA分子变性，双螺旋之间的氢键会断裂。然后短时间的80°C的加热会使这些单链DNA分子牢固结合到膜上。DNA分子与膜结合其碱基是自由的，可以自由配对。然后把探针加上标签，加热变性，再加到适宜核酸退火的化学溶液中与膜结合。经过一段时间，等杂交已经发生后，洗去没有结合的探针，干燥，现在就可以检测结合的探针的位置了，从而筛选出想要获得阳性克隆。另外给探针标记的方法，传统的是标记具有放射性的核苷酸，其杂交信号的位置可以通过放射自显影探测出来。不过，上述方法已经不再流行，部分是因为对人身体有伤害，部分是因为实验

25、产生的放射性污染物问题。因此现在有两种比较流行的方法，一种是使用dUTP和生物素反应，再用反应产物去标记探针，是探针带上生物素，结果可通过荧光标记的抗生物素蛋白去检出探针的位置。另一种方法是将探针DNA分子用辣根过氧化物酶标记，可发出化学荧光信号，这种信号可以被普通胶卷记录下来。实际上，我们可以通过已有的有关基因的信息来确定探针的性质。可以考虑一下3个可能性：（1）目标基因在某种细胞类型中高表达，可以考虑从这种特定细胞类型的文库中筛选出该基因。（2）该基因编码的蛋白质的氨基酸序列已知或部分已知。（3）该基因属于某个已知家族4.对天然质粒的人工构建、改造通常需要对质粒哪些方面进行操作、改进?答：

26、对于天然质粒应该做以下几方面的操作、改进：1.删除一些非必要的区段及对宿主有不良影响的区段2.削减载体的分子量，是载体具有更大的容纳外源片段的能力3.加上易于选择或检测的标记，以便筛选出阳性克隆4.限制性内切酶的酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体的特定位置5.加上一些调控元件，有利于基因的表达6.安全性改造（因为是简答题，以下四点可以不要，但建议最好要）:（1）非传递性和不被带动转移。在基因工程操作中，不希望载体能够进行自主传递，也不希望被带动转移（2）具有条件致死突变。如温度敏感时就丧失复制能力，可防止克隆基因扩散，只存在于限定的宿主细胞中（3）一般情况下不希望与宿主染色体发生重组，因为

27、重组后可能给宿主带来突变有较小的宿主范围5.假设你需要将一段cDNA克隆到表达载体中并转化到大肠杆菌中。cDNA的两端和载体上均有BamHI的酶切位点，你需要用BamHI切割cDNA和载体然后将它们连接在一起。下面是实验方法要求的具体步骤： a. 用BamHI处理载体DNA，然后用碱性磷酸酶去除5-端的磷酸基； b. 用BamHI处理cDNA, 然后与步骤a中得到的载体DNA混合，加入DNA聚合酶，在适当的条件下使cDNA与载体连接； c. 将步骤b 的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，培养后均匀涂在含有抗生素的琼脂培养皿上。 因为表达载体中含有抗性基因，能表达抵制抗生素的酶，所以只有含有载体的大

28、肠杆菌才可以在含有抗生素的培养皿上生长，而未被转化的细菌则因受到抗生素的抑制而死掉。 你还参照实验手册做了下面四组对照： 对照一、在含有抗生素的培养皿上面涂布未被转化的（即不含有载体的）大肠杆菌感受态细胞 （cells alone）。 对照二、用未被酶切的载体直接转化大肠杆菌感受态细胞，将产物涂布在含有抗生素的培养皿上面（vector alone）。 对照三、用BamHI酶切载体DNA后，不用碱性磷酸酶处理，不需要cDNA，直接加入DNA聚合酶，然后转化、涂板 (Omit phosphatase, omit cDNA)。 对照四、除使用碱性磷酸酶外，其它与对照三相同 (Omit cDNA)。

29、你一共做了三次实验，在第一次中所有的平板中都长出很多细菌。在第二次实验中所有的平板中都没有长细菌。在第三次实验中你得到了较好的结果，转化成功，具体克隆数见下表： Preparation of SampleNo. of Colonies 123Control 1Cells aloneTMTC00Control 2Uncut vectorTMTC0>1000Control 3Omit phosphatase, omit cDNATMTC0435Control 4Omit cDNATMTC025Experimental sampleTMTC034*TMTC = too many to coun

30、t请回答下列问题： A. 解释第一次实验失败的原因，并说明对照一的目的是什么； 答：抗生素失效或未加抗生素，对照一的目的是为了检验抗生素的有效性。B. 解释第二次实验失败的原因，并说明对照二的目的是什么； 答：电转化条件不正确，未转化成功。对照二的目的是为了检测转化效率和抗性基因。C. 对照三和对照四的目的是什么？为什么实验手册上建议用碱性磷酸酶处理载体？答：为了检测载体的自连情况。如果载体和外源片段末端都是平端的话，连接效率会很低，会有很多载体自连。我们用碱性磷酸酶处理一下载体，去掉载体5端的磷酸基团，这样载体就不会自连了，提高了和外源片段的连接效率。6. 某旋转对称DNA片段由8个碱基对组

31、成，其最先4个核苷酸为5-ACGG-3，求其完整的碱基序列。 5-ACGGCCGT-3 3-TGCCGGCA-57. 大肠杆菌乳糖操纵子的主要结构和阻遏蛋白的作用机制是什么？ 答：乳糖操纵子的结构：大肠杆菌的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码-半乳糖苷酶、透酶、乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因。基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于转录失活状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白CAP结合位点，由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成LAC操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达

32、。阻遏蛋白的负性调节：在没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻遏状态。此时，基因列在P启动序列操纵下表达的乳糖阻遏蛋白与O序列结合，故阻断转录启动。阻遏蛋白的阻遏作用并非绝对，偶有阻遏蛋白与O序列解聚。因此，每个细胞中可能会有寥寥数分子半乳糖苷酶、透酶生成。当有乳糖存在时，乳糖操纵子即可被诱导。真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖经透酶催化、转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数-半乳糖苷酶催化，转变为别乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构型变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录，使-半乳糖苷酶分子增加 1000倍。CAP的正性调节:分解代谢物基因激活蛋白CAP是同二聚体，在其分子内有D

33、NA结合区及cAMP结合位点。当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP结合，这时CAP结合在乳糖启动序列附近的CAP位点，可刺激RNA转录活性，使之提高50倍；当葡萄糖存在时，cAMP浓度降低，cAMP与CAP结合受阻，因此乳糖操纵子表达下降。由此可见，对乳糖操纵子来说CAP是正性调节因素，乳糖阻遏蛋白是负性调节因素。两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节乳糖操纵子的表达。对调节机制的解释:大肠杆菌根据碳源性质选择代谢方式。倘若有葡萄糖存在时，细菌优先选择葡萄糖供应能量。葡萄糖通过降低cAMP浓度，阻碍cAMP与CAP结合而抑制乳糖操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。在没有葡萄糖

34、而只有乳糖的条件下，阻遏蛋白与O序列解聚，CAP结合cAMP后与乳糖操纵子的CAP位点，激活转录，使得细菌利用乳糖作为能量来源。8.请列举出5种真核生物中存在的RNA 并概括它们的功能。答：生物体内主要有三种不同的RNA分子在基因的表达过程中起重要的作用。信使RNA（mRNA）、转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）。真核细胞中还有两类RNA，即不均核RNA（hnRNA）和小核RNA（snRNA）。hnRNA是mRNA的前体；snRNA参与hnRNA的剪接（一种加工过程）。自1965年酵母丙氨酸tRNA的剪辑序列确定以后，目前除多种tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA等较小的

35、RNA外，尚有一些病毒RNA、mRNA及较大的RNA的以及结构测定已完成，如噬菌体MS2RNA含3569个核苷酸。rRNA是核糖体的组成成分，由细胞核中的核仁合成，而mRNA、tRNA在蛋白质合成的不同阶段分别执行着不同功能。mRNA是以DNA的一条链为模版，以碱基互补配对为原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息传递过程中的桥梁。tRNA的功能是携带符合要求的氨基酸，以连接成肽链，再经过加工形成蛋白质。mRNA在真核细胞中，DNA主要贮存于细胞核中的染色体上，而蛋白质的合成场所存在于细胞之中的核糖体上，因此需要有一种中介物质，才能把DNA上控制蛋白质合成

36、的遗传信息传递给核糖体。现已证明，这种中介物质是一种特殊的RNA。这种RNA起着传递遗传信息的作用，因而称为信使RNA。mRNA的功能就是把DNA上的遗传信息精确无误地转录下来，然后再由mRNA的碱基顺序决定蛋白质的氨基酸序列，完成基因表达过程中的遗传信息传递过程。在真核生物中，转录形成的前体RNA中含有大量非编码序列，大约只有25%序列加工成为mRNA，最后翻译为蛋白质。因为这种未经加工的前体mRNA在分子大小上差别很大，所以通常称为不均一核RNA。tRNA 如果说mRNA是合成蛋白质的蓝图，则核糖体是合成蛋白质的工厂。但是，合成蛋白质的原材料20种氨基酸与mRNA的碱基之间缺乏特殊的亲和力

37、。因此，必须用一种特殊的RNA转运RNA（tRNA）把氨基酸搬运到核糖体上，tRNA能根据mRNA的遗传密码依次准确地将它携带的氨基酸连结起来形成多肽链。每种氨基酸可与1-4种tRNA相结合，现在已知的tRNA的种类在40 种以上。tRNA是分子最小的RNA，其分子量平均约为27000（25000-30000），由70到90个核苷酸组成。而且具有稀有碱基的特点，稀有碱基除假尿嘧啶核苷与次黄嘌呤核苷外，主要是甲基化了的嘌呤和嘧啶。这类稀有碱基一般是在转录后，经过特殊的修饰而成的。它们的碱基序列都能折叠成三叶草形二级结构，而且都具有如下的共性： 5末端具有G（大部分）或C。 3末端都以ACC的顺序

38、终结。 有一个富有鸟嘌呤的环。 有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。 有一个胸腺嘧啶环。rRNA 核糖体RNA是组成核糖体的主要成分。核糖体是合成蛋白质的工厂。rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起，形成核糖体，如果把rRNA从核糖体上除掉，核糖体的结构就会发生塌陷。真核生物有4种rRNA，分子大小分别是5S、5.8S、18S和28S，分别具有大约120、160、1900和4700个核苷酸。rRNA是单链，它包含不等量的A与U、G与C，但是有广泛的双链区域。在双链区，碱基因氢键相连，表现为发夹式螺旋。rRNA在蛋白质合成中的

39、功能尚未完全明了。但16 S的rRNA3端有一段核苷酸序列与mRNA的前导序列是互补的，这可能有助于mRNA与核糖体的结合。 snRNA 除了上述三种主要的RNA外，细胞内还有小核RNA（snRNA)。它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分。现在发现有五种snRNA，其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸。snRNA一直存在于细胞核中，与40种左右的核内蛋白质共同组成RNA剪接体，在RNA转录后加工中起重要作用。另外，还有端体酶RNA(telomeraseRNA)，它与染色体末端的复制有关；以及反义RNA(antisenseRNA)，它参与基因表达的

40、调控。有的RNA分子还具有生物催化作用。9. 简述原核生物转录起始与转录终止过程中涉及到的主要蛋白质和核酸结构及其具体作用(1) RNA聚合酶：催化RNA的生物合成(2）四种碱基：合成RNA的原料(3）因子：提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力。10. 试说明真核细胞与原核细胞在基因转录，翻译及DNA的空间结构方面存在的主要差异，表现在哪些方面？(）染色体方面：原核生物为环状DNA分子，且DNA裸露或结合少量蛋白质，只有一个基因连锁群；真核生物为线性双链DNA分子，且DNA同组蛋白和非组蛋白结合，有2个以上基因连锁群。(）染色体遗传物质：原核生物为质粒，真核生物为细胞器基因组。(）转录

41、单元：原核生物为多顺反子，真核生物为单顺反子，基因家族。(）DNA序列：原核生物无或很少有重复序列，真核生物有重复序列。(）基因表达：原核生物RNA和蛋白质在同一区间合成，有重叠基因；真核生物RNA在核中合成和加工，蛋白质在细胞中合成，有断裂基因ssss。答：一.转录1.RNA聚合酶原核生物的RNA聚合酶是一种多聚体蛋白质（2'）；真核生物的RNA聚合酶有三种（RNA聚合酶、），分别转录不同种类的RNA。2.转录过程原核生物的转录过程转录全过程均需RNA聚合酶催化。起始过程需核心酶，由亚基辨认起始点，被辨认的DNA区段是-35区。在这一区段酶与模板的结合松弛，酶移向-10区并跨入转录起

42、始点。延长过程的核苷酸聚合仅需核心酶催化。终止分依赖因子的和不依赖因子的转录终止。a.依赖因子的转录终止：结合后因子和RNA聚合酶都可发生构象变化，从而使RNA聚合酶停顿，解螺旋酶的活性使DNA/RNA杂环双链拆离，利于产物从转录复合物中释放。b.不依赖因子的转录终止：DNA模板上靠近终止出有些特殊碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊结构来终止转录。转录产物的3'-末端，常发现有多个连续的U。连续的U区5'-端上游的一级结构可形成茎环或发卡形式的二级结构。真核生物的转录过程转录起始前的-25bp区段多有典型的TATA序列，称为TATA box，通常认为这就是启动子的核心

43、序列。此外DNA分子上还具有其他可影响转录的顺式作用元件，以及能直接、间接辨认和结合转录上游区段的蛋白质反式作用因子，其中直接或间接结合RNA聚合酶的为转录因子。真核生物RNA聚合酶不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。真核生物的转录延长过程与原核生物大致相似。真核生物mRNA有polyA尾巴结构，是转录后才加进去的。转录不是在polyA位置上终止，而是超过数百甚至上千核苷酸后才停顿。1.原核生物与真核生物核蛋白体的组成不同。2真核生物肽链合成起始过程与原核生物相似但更复杂。真核生物有不同的翻译起始成分，起始因子种类更多，起始甲硫氨酸不需甲基化等。成熟的真核mRNA有5'帽子

44、和3'polyA尾结构。3.真核生物肽链合成的延长过程与原核生物基本相似，只是有不同的反应体系和延长因子。4.真核生物的翻译终止过程与原核生物相似。三.表达调控原核基因表达调控与真核存在很多共同之处。但因原核生物没有细胞核，亚细胞结构及其基因组结构要比真核简单得多。1.原核基因转录调节特点因子识别特异启动序列，不同的因子决定特异基因的转录激活，决定mRNA,rRNA和tRNA基因的转录。除个别基因外，原核生物绝大多数基因按功能相关性成簇的串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位操纵子。一个操纵子只含一个启动序列及数个可转录的编码基因。2.真核细胞结构及基因组结构远比原核复杂，其基因表

45、达调控机制发生在染色体活化、基因转录激活、转录后加工、翻译及翻译后加工等水平的调节事件也要复杂的多。四.DNA的空间结构1.原核生物DNA的高级结构 绝大部分原核的DNA都是共价封闭的环状双螺旋分子。在细胞内进一步盘绕，并形成类核结构，以保证其以较致密的形式存在于细胞内。在细菌基因组中，超螺旋可以相互独立存在。2.真核生物DNA的存在形式 在真核生物，DNA以非常致密的形式存在于细胞核中。在细胞周期的大部分时间里以分散的染色质形式出现在细胞分裂期形成高度组织有序的染色体。11. 什么是操纵子（operon)?试说明色氨酸操纵子（Trp operon)在原核基因表达调控中的调控机制和重要作用。操

46、纵子：是指数个功能上相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，所转录的RNA为多顺反子。单顺反子：在真核生物中，一个编码基因多转录成一个mRNA分子，经翻译只生成一条多肽链，这样的一个转录单位称为单顺反子，真核生物中的基因都是以单顺反子的形式存在。 色氨酸操纵子结构是一种负控阻遏系统，它含有5种结构基因：TrpE, D, C, B, A（2）它的调控结构：启动子，操纵子，前导序列，弱化子。（3）阻遏物Trp基因：它与Trp操纵子相距较远。大量Trp存在时，大肠杆菌的5种酶的转录同时受到抑制，Trp不足时 ，这5酶

47、基因开始转录。前导序列中含有衰减子区域，在前导序列中第10位和第11位有相邻两个色氨酸密码子，参与转录弱化机制。弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置：（1）当Trp浓度高时，可完整翻译成短肽，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录前，核糖体就到达2区，这样使2-3区不能配对，3-4区可自由配对形成茎-环状终止子结构，转录停止。Trp操纵子中的结构基因被关闭而不再合成色氨酸。（2） 当Trp浓度低时，负载有Trp的转运RNA也少，这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖体才到达1区，这时的前导区结构是2-3区配对，不

48、形成3-4区配对的终止结构，故转录可继续进行，直到将Trp操纵子的结构基因全部转录。12. 阐述酵母转录激活因子GAL4的调控方式及其在酵母双杂合系统(yeast two hybrid system)中的应用基本原理：（1）真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA结合域（BD），其C端768-881aa是转录激活域（AD）。一般情况下，AD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段（UAS）相结合，而此时，AD则推动了转录起始。 （2）若用基因工程的方法，将GAL4 AD和BD分别克隆到不同的载体上，导入同一细胞株中表达，效

49、应基因无法被激活,但可把来自不同转录因子的AD或BD区域连成一个功能基。（3）主要实验过程：a. 选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c；b. 构建带有GAL1 UAS-启动子-lac Z（His3）的转化载体;c. 把已知的靶蛋白质编码基因克隆到pGBT9的多克隆位点上，把所有cDNA都克隆到pGAD424载体上，构成cDNA表达文库。d. 从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒DNA，共转化感受态酿酒酵母菌株。e. 将共转化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。13. 乳糖操纵子的作用机制？答：1、乳糖操纵子的组成：

50、大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。3、CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结

51、合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。4、协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。14. 真核生物转录水平的调控机制？答：真核生物在转录水平的调控主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成过程。1、转录起始复合物的形成：真核生物RNA聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA形成的蛋白质-DNA复合物，只有当一个或多个转

52、录因子结合到DNA上，形成有功能的启动子，才能被RNA聚合酶所识别并结合。转录起始复合物的形成过程为：TFD结合TATA盒；RNA聚合酶识别并结合TFD-DNA复合物形成一个闭合的复合物；其他转录因子与RNA聚合酶结合形成一个开放复合物。在这个过程中，反式作用因子的作用是：促进或抑制TFD与TATA盒结合；促进或抑制RNA聚合酶与TFD-DNA复合物的结合；促进或抑制转录起始复合物的形成。2、反式作用因子：一般具有三个功能域（DNA识别结合域、转录活性域和结合其他蛋白结合域）；能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件；对基因的表达有正性或负性调控作用。3、转录起始的调控：反式作用因子的活性调节：

53、表达式调节反式作用因子合成出来就具有活性；共价修饰磷酸化和去磷酸化，糖基化；配体结合许多激素受体是反式作用因子；蛋白质与蛋白质相互作用蛋白质与蛋白质复合物的解离与形成。反式作用因子与顺式作用元件的结合：反式作用因子被激活后，即可识别并结合上游启动子元件和增强子中的保守性序列，对基因转录起调节作用。反式作用因子的作用方式成环、扭曲、滑动、Oozing。反式作用因子的组合式调控作用：每一种反式作用因子结合顺式作用元件后虽然可以发挥促进或抑制作用，但反式作用因子对基因调控不是由单一因子完成的而是几种因子组合发挥特定的作用。15. 真核生物转录后水平的调控机制？（1）、5端加帽和3端多聚腺苷酸化的调控

54、意义：5端加帽和3端多聚腺苷酸化是保持mRNA稳定的一个重要因素，它至少保证mRNA在转录过程中不被降解。（2）、mRNA选择性剪接对基因表达调控的作用（3）、mRNA运输的控制16. 分子克隆中常用的工具酶及良好载体的条件？（1）、常用的工具酶1、限制性核酸内切酶：是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。2、DNA连接酶：将两段DNA分子拼接起来的酶。3、DNA聚合酶：催化单核苷酸链延伸。4、逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称互补DNA。5、末端脱氧核糖核酸转移酶：将脱氧核糖核酸加到DNA的3末端。6、

55、碱性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基团。7、依赖DNA的RNA聚合酶：识别特异性启动子，RNA转录。（2）、良好载体的条件1、必须有自身的复制子；2、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点，即多克隆位点，以供外源DNA插入；3、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子；4、载体分子必须有足够的容量；5、可通过特定的方法导入细胞；6、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA调控元件。17. 3-脱氧腺苷-5三磷酸是ATP的类似物，假设它相似到不能被RNA聚合酶识别，如果在RNA转录时细胞中存在少量的该物质，会有什么现象？答：

56、因为3-脱氧腺苷-5三磷酸是ATP的类似物，所以在RNA转录时，它就会与RNA聚合酶结合。但3-脱氧腺苷-5三磷酸不能像ATP那样给转录过程提供能量，因而使得RNA转录停止。18. SANGER双脱氧链终止法的原理？答：DNA链中核苷酸以3,5-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是 2-脱氧核苷三磷酸。2,3ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延

57、伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。19. 核酸分子杂交的原理？核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。它的基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。因此，当用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地

58、结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。进行基因检测有两个必要条件：一是必需的特异的DNA探针；二是必需的基因组DNA。当两者都变性呈单链状态时，就能进行分子杂交。核酸分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键（主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交