siRNA设计研究进展及在线设计

1、siRNA设计研究进展及在线设计                            作者：樊鹏程, 贾正平, 马骏, 王荣【关键词】  siRNA设计 基因沉默 RNA干涉 序列分析研究基因功能的方法之一是减少或消除其在细胞中的表达。RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 技术可以研究一个单独

2、基因的作用, 其效应因子为小干扰RNA(small interfering RNAs, siRNA)分子1。并非所有针对某基因不同位置碱基所设计的21个碱基siRNA都有相似基因沉默效率, 针对同一mRNA内不同位置随机设计的siRNA表现明显不同活性2。siRNA沉默效率主要取决于21个碱基序列的合理设计, 如何设计针对目的基因的高效特异性siRNA是基因沉默的关键。使用生物信息学、 机辅助手段选择最佳siRNA正成为研究的热点3, 4。1  siRNA设计规则研究    借助生物信息学手段以选择最佳siRNA, 可使用一些筛选模型优化寡核苷酸序列性质

3、, 诸如G/C比例,   碱基变化以及序列中重复碱基数目。1.1  siRNA反义链5末端碱基设计  RNA诱导沉默复合体(RNAinduced silencing complex, RISC)形成的起始过程为一个解旋酶介导的siRNA末端解链过程。siRNA中一末端碱基配对越松散, 该末端越易被RISC解开。预测高效siRNA存在较松散的5反义末端5, 可在siRNA反义链同RISC结合时引导其识别目的mRNA序列。若siRNA正义链5末端为松散碱基配对, 则可能导致非目的基因的沉默。1.2  siRNA正义链设计  为确定siRN

4、A的特异性, Reynolds等系统地测定了针对萤火虫荧光素酶和人胞溶质蛋白B基因各197个碱基区域分别设计的各90个siRNA的沉默效率2。结果显示高效siRNA至少有超过3个A/U在15和19之间(正链末端的第1个碱基定义为位置1); A/U在19位, 该规则反映siRNA同发生的miRNA过程相类似; 正义链位置3存在一个A, 该结果支持miRNA同siRNA过程存在相似的蛋白机制的假说; A/U在10位, 提示激活的RISC可能是在距离5末端10到11个碱基位置针对mRNA发生作用。正义链19位不为G或C; 正义链13位不为G。1.3  G/C比例  复含G/C的序

5、列较富含A/T的序列更易形成稳定的双链, 因此在一个序列中不应同时存在超过7个G/C配对, 且同一序列中4个或更多的G因为易形成交连复合体而应被排除。测定dsRNA两末端的自由能及稳定性, 结果表明依19个碱基设计的siRNA, 其G/C配对比例不宜超过36.8%5。1.4  siRNA目的位置二级结构预测提高siRNA效率  siRNA双链末端不同热力学稳定性, 提示哪条链会进入RISC中。Heale等应用双链末端稳定性计算方法研究二级结构在siRNA设计中的作用, 发现双链末端稳定性对于沉默效果预测影响占60%, 二级结构预测可改善siRNA位点预测效率, 80%的非作

6、用位点可以通过二级结构预测来排除。1.5  内部重复序列  因包含内部重复序列或回文序列的siRNA可能形成潜在内部发卡结构或折叠结构, 降低了siRNA有效浓度及沉默效力, 故siRNA设计时应避免内部重复序列。2  通过非目的位点错配寻找高效siRNA    优化siRNA序列来实现同非目的基因的最小错配, 以最小化非目基因沉默。siRNA序列较短, 按照同非目的位点最少存在3个以上的错配, 一般有4至5个相邻的序列符合条件。故BLAST搜寻经常忽略了非目的候选物, 而现有的准确搜寻方法执行时间太长。Yamada等6开发的高效si

7、RNA算法, 能准确快速地列出对于任意人类基因siRNA序列的潜在杂交位点, 优于传统计算方法。3  高活性siRNA筛选算法、 模型研究3.1  自组装图形技术  Takasaki等7将自组装图形技术和统计显著性差异分析用于筛选高活性siRNA序列,   使用评分作为基因沉默效率的衡量。分析了针对12个基因中的172个siRNA序列, 并同其他已报道的评分方法做了比较, 结果其评分同基因沉默水平明显相关。3.2  热力学及结构特征优化神经模型的建立  建立可信的siRNA模型对于功能基因组研究十分必要, 通过分析siRNA

8、热力学参数及相关性分析, 优化得到的神经网络模型能够有效预测不同浓度siRNA沉默效率8。该模型仅需较少siRNA序列参数即可预测siRNA沉默效率, 减少了计算量。4  siRNA在线设计    Amhion, Dharmacon, Qiagen等公司网站及Whitehead siRNA Selection Web Server, siDirect和DEQOR等在线软件支持siRNA设计。Whitehead siRNA设计服务器集成已公布的设计规则, 为使用者提供21个碱基siRNA信息, 双链RNA热力学稳定性, G/C含量, 及其他可能对siRNA

9、干涉效果产生影响的特征参数。OptiRNAi软件工具, 通过植入的Blast搜索引擎来优化siRNA结合目标序列的特异, 是一款高效、 界面友好的RNAi搜索工具9。siDirect在线siRNA设计系统, 用于计算高效且对于哺乳动物细胞有着最大特异性的siRNA序列。通过列举出BLAST搜索可能忽略的潜在的杂交候选物, 避免对非目的基因的沉默。支持以任意碱基序列作为搜索项输入, 并很快返回候选siRNA, 提供较广泛的哺乳动物RNAi应用, 包括功能基因及相关基因的沉默。其网址为 http: /design.RNAi.jp/。BLOCKiTTM RNAi Designer使用专利算法允许RN

10、Ai Designer选择独特靶序列, 明显提高目的基因沉默效率, 其网址为: 目前的版本为1.7。该软件通过分析针对92个基因的、 有效的siRNA 398条, 应用氢键的能量分布进行设计。其界面友好, 可将序列通过在线服务器直接提交进行设计: http: /sisearch.cgb.ki.se/。Matveeva等10通过相关性分析, 对双链稳定性, 核苷酸位置依赖活性, 总G/C比例作为输入参数, 进行线性回归, 根据回归结果设计了siRNA scale程序。并比较了siRNA scale同BioPredsi, ThermoComposition, DSIR3个程序的siRNA预测效率。

11、siRNA scale预测siRNA同BioPredsi接近, 优于其他程序。目前多数基于网络的siRNA设计程序需要单独输入每个序列, 使大型批量分析难以实现, 且非目标位置的搜寻也受到限制。Batch RNAi selector通过执行WUBLAST, FASTA, SSEARCH同源搜索程序来改善siRNA筛选的特异性, 并确定可能导致非目的基因沈默的siRNA候选序列, 同时引入了siRNA评分及siRNA内部稳定性计算结果, 该程序可免费下载,运行平台为Linux11。Support vector machines使用限制性优化筛选模型, 利用已公布的2200个siRNA中被预测的最

12、为有效的572个序列, 包括其热力学性质、 同目的mRNA序列的可接近程度及自身发卡结构性质12。该工具可改善90%的活性siRNA位点预测, 网址为/。法国枫丹白露生物计算中心服务器结合siRNA序列基本性质来预测siRNA效率, 并通过大型siRNA序列数据库训练和测试, 能直接提供相关生物学性质, 网址为http:/cbio.ensmp.fr/dsir。siRNA Scan程序能够识别可能沉默非目的基因的siRNA序列, 并通过定量反转录PCR实验验证, 结果显示其预测非目的基因沈默的准确率接近50%。故该程序能够帮助筛选更好的转录后基因沉默的siRNA结构13。siRNArules为奥斯陆大学分子神经生物研究中心开发的一个siRNA沉默效率预测软件, JAVA语言编写, 源代码开放, 其访问网址为http: / 主要针对高分叉病毒高度保守序列设计。其设计目标为同病毒结构活性相关的保守区域, 故可能对高度变异病毒亦有效。其对于HIV和HCV及SARS等